自发性2型糖尿病模型db/db小鼠生物学特性研究❋

王松月，依香叫，李金诚，白颖慧，周 虹，李金波，裴凌鹏Δ

(1. 民族医药教育部重点实验室，中央民族大学药学院，北京 100081； 2. 悉尼大学NAZAC研究所， 澳大利亚； 3. 纽约州罗切斯特大学病理与药物系，美国)

db/db小鼠是美国Jackson实验室发现的位于 4 号染色体的Leptin 受体基因缺陷导致的自发性 2 型糖尿病小鼠。前期研究表明[1-5]，本品系小鼠于出生4周后就会出现肥胖、高血糖、高血脂、糖尿等一系列糖尿病的症状，其生理性与行为性特征与人类2型糖尿病表现极为相似，目前被认为是较理想的2型糖尿病(T2DM)研究用动物模型。中医学认为，糖尿病属于“消渴”范畴，本病的基本病机为“本虚标实”，主要病位在肾，其次在肺胃等脏腑，肺脾肾气虚是其发病基础，瘀血、水湿、痰浊则为其主要外邪。目前，糖尿病已成为全球范围内的一种重大疑难性疾病，具有高发病率与并发症高致残率、死亡率等特点。糖尿病关键统计指南预测，截止2035年全球T2DM患病人数可能达到5.92亿[6]，而糖脂代谢失调将造成肾脏组织形态病变与功能性紊乱，最终引发慢性肾病，从而促使机体内分泌代谢、激素代谢以及钙吸收等一系列的问题，成为诱发继发性骨质疏松症发生的最主要因素[7]。为此，本实验旨在针对db/db小鼠生存周期过程的动态观测，研究糖代谢紊乱-肾病-骨质疏松症之间的关系，进一步验证中医“肾主骨”理论的科学性，并为此品系小鼠作为2型糖尿病骨质疏松症模型的可能提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级7周龄雄性自发性2型糖尿病BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/Nju品系的db/db小鼠70只，体质量(27.03±1.60)g；基因型(Leprdb)wt/wt的db/m小鼠40只，体质量为(15.40±2.34)g，均购自南京大学-南京生物医药研究院[SCXK(苏)2015-0001 ]。并全部在中国中医科学研究院清洁级实验室[SYXK(京)2016-0021 ]进行饲养及实验。

1.2 实验分组

按照体质量随机分组，模型组(db/db雄性小鼠)和对照组(db/m雄性小鼠)各9组(依据动态观测9个不同时间点，即7、8、9、10、11、12、16、20、24周)，模型组每组包含基因型(Leprdb)mut/mut的db/db小鼠7只，对照组每组包含基因型(Leprdb)wt/wt的db/m小鼠4只，饲养期间给予充足的纯净水，自由摄食，室温在20～25 ℃之间，明暗交替照射12 h/12 h。

1.3 主要仪器及试剂

Life Scan Europe 生产的Ultra血糖仪及其配套血糖试纸；全自动生化分析仪(日立7020)；电子显微镜(日本 Olympus公司)；脱水机(武汉俊杰电子有限公司)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；组织切片机(浙江金华市科迪仪器设备有限公司)；载玻片及盖玻片(江苏世泰器材有限公司)；正丁醇、无水乙醇、二甲苯、盐酸、氨水、中性树胶(国药集团化学试剂有限公司)；HE染液套装(武汉谷歌生物科技有限公司)；CREA试剂盒、ALP试剂盒(中生北控公司，批号160601与批号160821)；BUN试剂盒(maccura公司，批号0517021)。

1.4 实验方法

1.4.1 db/db和db/m小鼠的血糖测量 分别于第7、8、9、10、11、12、16、20、24周测定该周龄模型组与对照组的空腹血糖，检测前将小鼠禁食8 h，经尾静脉取血，用血糖仪测定小鼠的血糖值。

1.4.2 db/db和db/m小鼠的体质量测量及样本采集 分别于第7、8、9、10、12、16、20、24周，测定模型组与对照组的体质量；眼球取血法收集血液200 μL，6000 r·h-1，离心15 min后分离血清，于-20 ℃冷冻储存，后续按照试剂盒提供的实验方法，分别检测血清ALP、BUN、CREA的含量。而后进行处死，收集脑、心、肺、肝、肾、睾周脂肪并称重，计算脏脑系数(即脏器(或脂肪)质量/脑质量)。

1.4.3 肾脏、胫骨不同组织病理学观察 将不同时间点的模型组与对照组肾脏、胫骨放置于4%多聚甲醛中固定24 h，再次经过梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片及HE染色，在显微镜下观察并拍照。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 空腹血糖水平

表1显示，与对照组比较，第7周模型组的所有空腹血糖值升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；从第8周开始模型组空腹血糖值明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 血糖值水平比较

注：与db/m小鼠比较：▲P<0.05

2.2 体质量变化

图1表2显示，从第7周到第24周，db/db小鼠体质量明显高于db/m小鼠而且增长迅速(P<0.01)，而db/m小鼠体质量比较稳定并未随着周龄增长而明显增高。

表2 体质量水平比较

注：与db/m小鼠比较：▲▲P<0.01

2.3 脏脑系数测定

表3显示，前期研究表明[8]，绝对器官质量可能存在个体间的变异性，而脏脑系数则可以减少这些可变性，更准确地反映机体真实状况。本实验结果表明，与对照组比较，第7周开始模型组的心脑系数、肝脑系数、肺脑系数、睾周脂肪脑系数、肾脑系数均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表3 db/db与db/m小鼠的脏脑系数比较

注：与db/m小鼠比较：▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.4 生化指标测定

表4显示，与对照组比较，第8周开始模型组血清CREA、BUN水平有所升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。第12周开始上述水平又明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。而血清ALP水平则呈现先降低后升高的趋势，在第16周开始其水平较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

表4 血清ALP、BUN和CREA水平比较

注：与db/m小鼠比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01

注：图左下为db/m小鼠，图右上为db/db小鼠图1 24周龄db/db小鼠与db/m小鼠体型比较

2.5 组织病理学变化

图2 8周龄db/db小鼠与db/m小鼠肾组织病理变化

2.5.1 肾组织病理观察 图2显示，8周龄的db/m小鼠肾小球形态完整，无细胞核变异，肾小管上皮形态结构正常；比较之下，db/db小鼠肾组织切片可见，肾小球基底膜均质性增厚，肾小球系膜基质增多，肾小囊基底膜增厚。

2.5.2 骨组织病理观察 图3显示，24周龄db/m小鼠骨小梁粗壮，排列整齐，骨小梁密度、面积正常；比较db/db小鼠骨组织切片可见，部分骨小梁变细，形态结构不完整，空骨窝增加，骨密度和面积减少。

图3 24周龄db/db小鼠与db/m小鼠胫骨病理变化

3 讨论

前期研究表明[9]，db/m小鼠与db/db小鼠母系相同，且db/m小鼠的体质量、血糖一直处于相对正常的水平。因此本次实验选取db/m小鼠作为对照组，可以更好地观察db/db小鼠在不同生长周龄的体质量、血糖等变化情况。

本实验通过对db/db小鼠7～24周的连续动态监测，发现在第8周开始db/db小鼠的空腹血糖值明显升高，至第10周后后续一直保持在高血糖水平，表明10周龄后本品系小鼠已达到2型糖尿病血糖值标准。同时，db/db小鼠的体质量一直呈现持续增长状态，各脏器组织/脑系数明显高于db/m小鼠(P<0.01)，表明db/db小鼠符合自发肥胖的特征。上述结果与相关研究报道及实验动物提供方的实验动物模型说明基本一致[10-12]。

随着db/db小鼠机体糖脂代谢失控，引发其肾脏组织形态学病变，导致功能性紊乱。前期研究表明[13-14]，肾脏排泄功能损害时尿素将在血中滞留，而导致血清BUN、CREA水平增加。本实验结果也表明，在空腹血糖持续升高过程中，自第7周开始db/db小鼠血清BUN、CREA水平有所升高，并在第12周开始与对照组差异显著，说明db/db小鼠可能出现了严重的肾脏排泄功能损伤。相比之下，血清ALP的变化则呈现“先降低后升高”的趋势。究其原因可能是由于高血糖而引起渗透性利尿，导致镁离子的丢失，同时尿糖增加又会让镁离子在肾小管的重吸收受到抑制，进而加重血浆镁离子减少。而镁离子作为ALP的激活剂，其含量的降低则会引起血清ALP的降低[15]，故在糖尿病前期血浆中的ALP先呈现降低趋势；随着糖尿病病情发展，其引发的脂类代谢障碍，造成肝脏受损，加之骨吸收程度增强，其变化逐渐呈现急速升高趋势，实验结果表明，血清ALP自第16周开始与对照组比较出现明显升高，差异显著(P<0.05)。与此同时，随着骨形成-骨吸收失衡加剧，结合不同时间胫骨骨组织病理观察，发现第24周开始出现骨小梁变细、形态结构不完整、间隙增大等现象和病理学变化。

综上所述，db/db小鼠先在第8周出现肾脏组织形态病变与轻度功能性失调，至第12周出现肾脏功能严重损伤，而后在第16周出现骨代谢紊乱，第24周出现骨小梁结构的改变，诱发骨质疏松症的发生。再次验证了肾中精气虚少，骨髓化源不足，骨不能得到髓的滋养，从而引起骨髓空虚，导致骨质疏松症的中医论断。故此，利用db/db小鼠作为进一步探索2型糖尿病肾与骨之间的关系以及糖尿病骨质疏松症的可行性模型提供了很好的依据。