弓形虫多态性GRA15 蛋白的研究进展

马叶婷，高文伟，周芃来，刘 卿，马海利，张 鼎

(山西农业大学动物科技学院,山西 太谷030801)

龚地弓形虫(Toxoplasma gondii,T.gondii)是引起人兽共患弓形虫病的专性胞内寄生原虫,几乎能感染所有的温血动物[1-2]。全球约有三分之一的人口感染弓形虫,我国平均人群弓形虫感染率为7.88%[3-4]。感染弓形虫后,虽然免疫功能正常的人无明显症状,但是免疫功能低下者会遭受严重的伤害甚至死亡[5]。例如,孕妇感染弓形虫后,可导致流产、死胎及婴幼儿的先天性弓形虫病[6]；儿童感染弓形虫后,一般表现为双眼失明、视网膜脉络膜炎及急性脑炎等。同时,弓形虫的感染也会增加罹患精神分裂症的风险,是精神分裂症的致病因素之一[7]。在农业生产上,弓形虫可导致怀孕家畜流产、产死胎或弱胎,严重时甚至导致动物死亡,增加动物的患病率、死亡率和治疗成本,给畜牧业带来巨大的经济损失[8]。另外,弓形虫感染在导致肉、奶、蛋、毛等产品质量、产量下降,即对养殖业造成重大经济损失的同时,污染的动物食品和制品等也会随着人类的消费将虫体传播给人类。鉴于此,弓形虫病的防控及病原研究在公共卫生和畜牧生产上均具有重要意义。

弓形虫感染宿主细胞离不开其分泌的微线体蛋白(Microneme proteins, MICs)、棒状体蛋白(Rhoptry proteins,ROPs)和致密颗粒蛋白(Dense granule antigens,GRAs)等[9]。这些效应因子在虫体粘附、入侵、宿主细胞内增殖和逸出等过程发挥着重要的作用[10-13]。通过数量性状遗传位点等分析手段发现,其中一些效应因子具有多态性,是决定不同基因型弓形虫毒力差异的重要因素。目前鉴定出的弓形虫多态性蛋白有ROP5、ROP16、ROP18、GRA2 和GRA15 等。目前已有较多关于对弓形虫RH、GT1 和PRU 虫株GRA15 蛋白功能的比较分析的报道[14-15]。本文就弓形虫GRA15蛋白的结构、在虫体与宿主互作中的作用、免疫保护性等方面的研究进展进行综述,为深入研究弓形虫不同基因型虫株的致病分子机制提供背景资料。

1 GRA15 蛋白结构特点

ToxoDB 数据库(http://toxodb.org/toxo/)及相关研究显示,弓形虫多态性GRA15 蛋白氨基酸序列长度有4 种,分别为278 aa、312 aa、550 aa 及635 aa(见表1)。I 型虫株GRA15 蛋白多态性丰富,其不同虫株GRA15 蛋白氨基酸序列长度包括以上278 aa、312 aa、550 aa 及635 aa 4 种(见表1)。由于编码时存在移码,I 型RH-ERP 虫株和RH-JSR 虫株的GRA15 基因分别编码312 和278 个氨基酸[15]；其他I 型虫株GRA15 基因分别编码550 或635 个氨基酸[16]。II 型虫株GRA15 基因编码550 个氨基酸,III 型虫株GRA15 基因编码635 个氨基酸。长度为550 aa 的GRA15 蛋白比长度为635 aa 的GRA15 蛋白缺失85 个氨基酸,其中84 个位于C端,1 个位于N 端。另外,还有5 个位点的氨基酸不同(见表1)。

表1 弓形虫不同基因型虫株的GRA15 蛋白的结构特点

对II 型虫株GRA15 蛋白的结构进行分析,结果显示,其有一个跨膜区和一个PEXEL 样的motif。PEXEL 样的motif 在疟原虫上可作为分选信号指导虫体蛋白进入宿主的红细胞。相反,PEXEL 样的motif 在弓形虫上不是指导虫体蛋白进入宿主细胞,而是能够增强蛋白定位到纳虫囊泡膜上的能力[17]。据报道,II 型PRU 虫株GRA15 蛋白可以定位到宿主细胞核内,这说明弓形虫PRU 虫株很可能存在剪切GRA15 蛋白PEXEL 样的motif 的机制[18]。

2 GRA15 蛋白对宿主细胞的影响

2.1 对NF-κB 细胞信号通路的影响 Rosowski等[14]对北美及欧洲流行的RH-ERP 强毒株和PRU弱毒株GRA15 蛋白功能进行了比较分析,发现PRU弱毒株GRA15 蛋白在虫体对宿主细胞调节过程中发挥着重要的作用,即能够高水平引起宿主细胞NF-κB 信号通路的激活。激活机制很可能是,首先PRU 虫株的GRA15 蛋白跟IKK-β 或TRAF6 形成复合体,引起IκB 的磷酸化和降解；之后引起p50 和p65 或c-Rel/p50 二聚体向细胞核内转移,最终影响了一系列的与免疫、凋亡及炎症相关的基因的转录和翻译[19]。

PRU 虫株的GRA15 蛋白激活NF-κB 信号通路引起的变化包括导致宿主细胞分泌IL-12,IL-12 又会刺激自然杀伤细胞和T 淋巴细胞分泌IFN-γ,从而使宿主能更好的抵抗弓形虫感染；另外,GRA15蛋白激活宿主的NF-κB 信号通路后,引起单核细胞分泌IL-1β,而IL-1β 是调节炎症极其重要的分子[20]。PRU 虫株的GRA15 蛋白激活NF-κB 信号通路可以使巨噬细胞向M1 方向极化,而将此巨噬细胞给小鼠接种后能够明显降低血吸虫感染引起的肝纤维化[21],这提示,PRU 虫株的GRA15 蛋白可作为潜在的治疗肝纤维化药物；而将此巨噬细胞给小鼠接种后还能够明显抑制体内肿瘤的生长,这提示,PRU 虫株GRA15 蛋白有作为新的治疗手段来增强宿主免疫力并抵抗肿瘤的潜力[22]。据报道,PRU 虫株的GRA15 蛋白还能够增强宿主对虫体的抵抗力和减轻肠道中由弓形虫感染引起的炎症[23]。

然而,与PRU 虫株GRA15 蛋白相比,RH-ERP强毒株GRA15 蛋白仅具有微弱激活宿主NF-κB信号通路的作用,并且采用NF-κB 荧光素酶报告系统对该种程度的激活作用进行检测时,检测不到酶活力[15]。这是由于RH-ERP 虫株GRA15 蛋白编码时移码,是非功能性蛋白。基于RH-ERP虫株以上遗传背景,Yang 等[15]将GRA15GT1基因导入RH-ERP 虫株构建RH-ERP+GRA15 GT1 互补株并感染NF-κB 信号报告细胞,结果表明,RH-ERP+GRA15GT1互补株能够明显引起NF-κB 报告基因表达,这说明GRA15 GT1 蛋白能够高水平激活宿主NF-κB 信号通路。尽管GT1 强毒株感染细胞后能够引起NF-κB 信号通路改变,但是其激活NF-κB信号通路作用比PRU 弱毒株弱2 ～3 倍。一种可能是GRA15GT1蛋白受到GT1 虫株其他基因的抑制作用,导致功能减弱。另一种可能是GRA15GT1蛋白比GRA15PRU蛋白多了85 个氨基酸和5 个位点的氨基酸存在不同导致的。相关研究表明,弓形虫GT1 虫株GRA15 蛋白激活NF-κB 信号通路的结构域为第194 ～518 氨基酸残基[19]。 另外,Wei 等[24]将 弓 形 虫 Ctwh3 虫 株 的 GRA15(GRA15Ctwh3)蛋白转染绒毛膜癌JEG-3 细胞发现,GRA15Ctwh3蛋白可通过触发内质网应激引起细胞凋亡。

2.2 对宿主其他方面的影响 PRU 虫株GRA15 蛋白还能招募p65 鸟苷酸结合蛋白1(GBP1)聚集于纳虫囊泡膜上,破坏纳虫囊泡从而杀灭弓形虫。这种招募机制不依赖于GRA15 蛋白激活NF-κB 信号通路,因为GBP1 蛋白是在感染后1 小时聚集,而GRA15 蛋白激活NF-κB 信号通路发生在感染后4小时[25]。

3 与GRA15 蛋白互作的宿主蛋白

通过酵母双杂交技术发现,PRU 虫株GRA15蛋白能够与小鼠Luzp1 蛋白互作[26]。 而小鼠Luzp1 蛋白具有3 个核定位序列且能够作为Two-A-containing histone acetyltransferase(ATAC)和Mediator complex(MED)的桥梁分子,从而形成稳定的Meta-coactivator complex(MECO)复合体,该复合体是一些非编码RNA 的调节因子[27-28]。这很可能表明弓形虫PRU 虫株通过借助GRA15 蛋白与宿主Luzp1 蛋白的相互作用定位到细胞核。另外,也不排除PRU 虫株的GRA15PRU蛋白通过与宿主Luzp1 蛋白的相互作用,以干扰宿主的Luzp1 蛋白行使正常功能的可能性。另外,据报道,PRU 虫株的GRA15 蛋白很可能跟IKK-β 或TRAF6 形成复合体[14]。

4 GRA15 的免疫保护作用

目前弓形虫病的治疗主要依赖化学药物,但是存在耐药性、药物残留及不能有效杀死细胞内的弓形虫包囊等问题。因此,关于弓形虫病的疫苗研究一直是科学家研究的热点。目前弓形虫仅有用于绵羊免疫接种的S48 弱毒虫株疫苗Toxovax®[29]。近年来,弓形虫的基因工程疫苗成为研究的热点和焦点。Chen 等[30]将PRU 虫株GRA15基因构建真核重组表达质粒pVAX-GRA15,对昆明种小鼠进行免疫保护试验,结果显示,PRU 虫株GRA15 蛋白能够引起较强的Th1 型免疫应答；与对照组比较,免疫小鼠的存活时间延长,脑包囊数量减少。李曼[31]将弓形虫Chinese I 型Wh3 株的GRA15 构建真核重组表达载体WH3-GRA15-GFP,对BALB/c 小鼠进行免疫保护试验,结果显示,WH3 虫株GRA15 蛋白不能有效诱发BALB/c 小鼠的体液免疫和细胞免疫。例如,实验组与对照组比较IFN-γ 水平没有明显升高。但是从GRA15蛋白能够激活NF-κB 信号通路的角度来说,GRA15 蛋白在宿主细胞内表达后会引起IFN-γ 水平升高。因此,弓形虫GRA15 蛋白能否作为疫苗候选分子需要进一步的研究,比如增加接种的剂量和改变接种的部位等。另外,GT1 虫株GRA15蛋白是否能够作为疫苗候选分子也需要进行研究。

5 展望

弓形虫GRA15 蛋白是具有多态性的重要的毒力因子。至今,关于其对宿主细胞信号通路的影响、在虫体与宿主蛋白互作中的作用及功能的初步应用的研究较多。但是,研究的焦点集中在弓形虫PRU 弱毒株GRA15 蛋白,而对弓形虫强毒株GRA15 蛋白的研究相对较少,例如,GT1 虫株。此外,弓形虫PRU 弱毒株GRA15 蛋白是否真正的能应用于抗肝纤维化和抗癌,需要进一步的研究。今后,相信随着对弓形虫各虫株GRA15 蛋白研究的全面深入,将会为防治弓形虫病及其他疾病奠定坚实的理论基础。