紫花地丁-芦荟紫花地丁-双花连翘提取物对大肠杆菌O2 的联合抑制作用研究

郭时金，董 林，唐世云，徐倩倩，王艳萍，3，杨丽梅，付石军，沈志强

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东 滨州256600；2.山东绿都安特动物药业有限公司,山东 滨州2566004；3.山东省滨州畜禽蜂胶疫苗研究开发推广中心,山东 滨州256600)

由大肠杆菌感染导致的畜禽流行性大肠杆菌病给畜禽养殖产业带来了严重的威胁,已严重制约了养殖业健康发展,同时,随着养殖规模的发展壮大,以及绿色养殖和环保事业的发展,抗生素在养殖事业中的使用受到越来越多的限制,因此而生的中兽药愈来愈受到青睐[1-3]。

中兽药是中兽医学防治疾病的重要手段,中兽药的配伍与禁忌是提高临床疗效,保证中兽药用药安全的重要环节。中兽药因具备有效成分多、无残留、作用靶位多、作用范围广、不易产生耐药性等优点成为新型抗菌药物及抗菌药物增效剂的筛选靶点之一。

紫花地丁为堇菜科堇菜属多年生草本植物,可全草入药。中医记载,紫花地丁具有清热解毒、凉血消肿之功效。其主要化学成分为黄酮和香豆素类化合物[1-4]。紫花地丁的提取物已被证明具有广谱的抑菌活性[5-6]。芦荟为百合科植物库拉索芦荟、好望角芦荟或其他同属近缘植物叶的汁液浓缩干燥物。具有清热凉肝,健脾,通肠作用。金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花。连翘为木犀科植物连翘的干燥果实。具有清热解毒,消肿散结的作用。

本试验以紫花地丁-芦荟、紫花地丁-双花连翘提取物两个药物对大肠杆菌的抑制为研究对象,通过微量棋盘法筛选最佳配比,达到合理用药、节约用药的目的,以期为中兽药发展做出微薄贡献。

1 材料与方法

1.1 药材 紫花地丁、芦荟,均购自安国伊康药业有限公司；双花连翘提取物,购自四川恒瑞通达生物科技有限公司；0.5 麦氏比浊管、MHB、MHA 培养基等,均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 菌株 大肠杆菌O2标准菌株由安徽农业大学基础兽医学教研室馈赠。

1.3 仪器 ST16R 离心机,美国ThermoFisher ST 16R；RE-52AAA 旋转蒸发器,上海嘉鹏科技有限公司；SH-B 95A 型循环水式多用真空泵,上海豫康科教仪器设备有限公司；台式小型离心机,Sigma 公司。

1.4 试验方法

1.4.1 药物的提取及浓缩 称取20 g 紫花地丁,加入0.8 L 水冷凝回流煮沸1 h,再加入0.4 L 水冷凝回流煮沸1 h,3 000 r/min 离心10 min,-0.1 Mpa浓缩至1 g/mL；称取20 g 芦荟,加入40 mL 加热使溶解,3 000 r/min 离心10 min,-0.1 Mpa 浓缩至0.5 g/mL。

1.4.2 制备大肠杆菌菌液 将大肠杆菌O2菌株,挑取平板上的单菌落,接种至营养肉汤培养基中,置37 ℃培养箱中,过夜培养,稀释至每毫升含细菌1.5×105CFU。

1.4.3 紫花地丁、芦荟、双花连翘提取物最低抑菌浓度的检测 以微量稀释法(Microdilution)进行:取U形底96 孔板,在第1 ～9 孔中每孔加入MHB 50 μL,第1 孔加入药物原液50 μL,混合均匀后,依次倍比稀释至第9 孔,自第9 孔中吸取50 μL 弃去。第10 孔加入MH 肉汤100 μL 作为空白对照,第11 孔加入药物原液100 μL 作为药物对照,第12 孔为菌液对照(加入MH 肉汤50 μL)；在第1 至9 孔和12 孔各加入以上制备好的菌液50 μL；加完液后盖上盖,振荡混匀,置入垫有湿润纱布的方形盘内,于36 ℃培养18 ～24 h 后,观察结果。见表1。

表1 微量稀释法药物加入方法

1.4.4 紫花地丁-芦荟、紫花地丁-双花连翘提取物联合抑菌效果的测定 微量棋盘稀释法,基本方法同微量稀释法。用灭菌后的96 孔微孔板,在第1 ～6 行沿X 轴方向(从左到右)每孔中依次加入:MHB,1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC 的紫花地丁药液各25 μL,以同样的方法在第A-F 列沿Y轴方向(从上到下)每孔中依次加入8 MIC、4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2 MIC 的芦荟(双花连翘提取物)提取物液、MHB 各25 μL,将两药混合均匀。然后加入制备好的菌液50 μL,使最终抗菌药物浓度与计划稀释度相同,加液完毕,盖上盖,振荡混匀,放入垫有湿纱布的方盘内,36 ℃培养18 ～24 h,观察结果。棋盘稀释法药物加入方法按表2,并设立平行样。两种药物组合后每孔的最终浓度则为原药物浓度的1/4。加液完毕后放入36.5 ℃培养箱,培养18 h。

1.4.5 结果判定标准 用消毒棉签将U 型底96孔聚乙烯微孔板的每孔培养物转移至MHA 平板,置于36.5 ℃培养箱,培养过夜,观察细菌生长情况,如平板上有细菌生长,则为该孔为阳性,即药物浓度达不到抑菌效果；如无细菌生长,则该孔为阴性,即药物浓度达到抑菌效果。

2 结果

2.1 紫花地丁、芦荟提取结果 紫花地丁、芦荟的终浓度分别为1.0 g/mL、0.5 g/mL。

2.2 最低抑菌浓度(MIC)

2.2.1 单独用药时紫花地丁MIC 为1/4 原液,芦荟MIC 为原液,双花连翘MIC 为1/4 原液。

2.2.2 联合抑菌效果 紫花地丁与芦荟联用时,紫花地丁的MIC(联)=1/64 原液,芦荟联用时的MIC(联)=1/32 原液；紫花地丁与双花连翘提取物联用时,紫花地丁的MIC 为1/16 原液,双花连翘提取物的MIC(联)=1/4 原液。

表2 棋盘稀释法药物加入法

2.2.3 联合抑菌FIC FIC(紫花地丁-芦荟)=紫花地丁联用时的MIC/紫花地丁单测时的MIC+芦荟联用时的MIC/芦荟单用时的MIC=(1/64 原液)/(1/4 原液) +(1/32 原液)/(1 原液) =0.093 75 ＜0.5,二者表现为协同作用。

FIC(紫花地丁-双花连翘提取物)=紫花地丁联用时的MIC/紫花地丁单测时的MIC+双花连翘联用时的MIC/双花连翘单用时的MIC=(1/16原液)/(1/4 原液)+(1/4 原液)/(1/4 原液)=1.25 ＞1,二者表现为无关作用。

3 结论

紫花地丁与芦荟联用时表现为协同作用；紫花地丁与双花连翘提取物联用时表现为无关作用。

4 结果分析与讨论

由于中药成分复杂,不同中药提取物抗菌活性不同,作用机理不同于抗生素,疗效往往受中药各成分间的协同和综合作用影响[2-7]。

关于紫花地丁与芦荟、紫花地丁与双花连翘提取物这两个药物联合抑菌试验均未见相关报道。由以上试验结果可知,紫花地丁单独应用时,最低抑菌浓度为1/4 原液,芦荟单独用药时,抑菌浓度为原液,当二者联合应用时,紫花地丁抑菌浓度为1/64 原液,芦荟抑菌浓度为1/32 原液,FIC=0.093 75,表现为协同作用；双花连翘提取物单用时的MIC 为1/4 原液,与紫花地丁联用时,最低抑菌浓度为1/16 原液,降为原来的1/4,紫花地丁的抑菌浓度不变,FIC=1.25 ＞1,表现为无关作用。

说明紫花地丁与芦荟联合应用后,抑菌效果明显增强；紫花地丁与双花连翘提取物联合应用后,抑菌效果没有明显增强,二者表现为无关作用,目前尚未见到紫花地丁和芦荟或双花连翘提取物联合抑菌方面的报道,此研究结果为紫花地丁和芦荟或双花连翘提取物的进一步研究奠定了基础。