液相色谱－串联质谱法测定动物源食品中氯霉素类药物及其代谢产物残留的方法

张 佳 王 丹 关婷婷 成林林 张慧利

（焦作市畜产品质量安全监测中心，河南焦作 454000）

1 方法原理

样品中的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在碱性条件下，用乙酸乙酯提取，提取液浓缩干后，残渣用甲醇溶液溶解，经正己烷液液分配脱脂，液相色谱一串联质谱仪测定，采用内标法定量。

2 试剂、材料与溶液

除特别注明外，以下所用试剂均为分析纯：水为符合GB/T 6682规定的一级水；标准品：氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）、氯苯尼考（FF）、氯苯尼考胺（FFA）；内标物：氯霉素D5（CAP-D5）、甲砜霉素D3（TAP-D3）、氯苯尼考D3（FF-D3）、氟苯尼考胺D3（FFA-D3）；甲醇色谱纯；乙腈色谱纯；氨水；乙酸乙酯；正已烷；甲酸铵；微孔滤头孔径0．22μm。

标准贮备液：取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯苯尼考胺标准品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，用甲醇超声溶解并稀释成浓度为100μg/ml的标准贮备液。-20℃冰箱中保存。内标贮备液取氯霉素D5（CAP-D5）、甲砜霉素D3（TAP-D3）、氯苯尼考D3（FF-D3）、氟苯尼考胺D3标准品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，用甲醇超声溶解并稀释成浓度为100μg/ml的内标贮备液。-20℃冰箱中保存。

混合标准中间工作液：准确量取标准贮备液各0.1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释成浓度为1μg/ml的混合标准工作，从中取1ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释成浓度为100 ng/ml的混合标准中间工作液。

混合内标中间工作液：准确量取内标贮备液各0.1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释成浓度为1μg/ml的混合内标工作液，从中取1ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释成浓度为100ng/ml的混合内标中间工作液。

3 仪器与设备

液相色谱一串联质谱仪（配电喷雾离子源）美国Water公司Waters UPLC TQ－S；天平感量0.01g；分析天平感量0.0001g；组织匀浆机；涡旋混合器；振荡器；离心机；氮吹仪；移器；聚四氯乙烯离心管（50ml）。

4 方法步骤

4.1 试样的制备与保存

取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，绞碎并使均匀。

试剂空白不加试样外，与待测试样同步处理。

空白样品取空白试样，与待测试样同步处理。

添加样品取空白试样5g，添加100ng/ml的混合标准中间工作液0.05ml，制得浓度为1μg/kg的阳性添加试料，与待测试样同步处理。

4.2 提取

称取试样5土0.02g，置于50ml离心管中，加入100 ng/ml混合内标工作溶液50μl，加入氨水0.5ml，乙酸乙酯15ml，涡旋振荡提取15min，14000 r/min离心5min。用吸管吸取上层液体于另一个50ml离心管中。残渣用乙酸乙酯10ml重复提取一次，合并提取液，于50～60℃水浴氮气或空气吹干。

4.3 净化

加入20%甲醇溶液1mL，涡旋混合使溶解。再加入正己烷2ml，轻摇脱脂，14000r/min离心或静止使分层，将下层液体转移至15ml进口尖底离心管中，2000r/min离心10min。用注射器小心吸取离心后的清液，过0.22μm微孔滤膜，供液相色谱一串联质谱仪测定。

5 仪器参数与测定

色谱柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18（1.7μm，2.1mm×100mm）

柱温：30℃；流动相：A：乙腈：B：10 mmol/L甲酸铵溶液，进样量：5L；离子源：电喷雾ESI；扫描方式：负离子扫描/正离子扫描；采集模式：多反应监测MRM

电离电压：负离子模式3．0kV，正离子模式15kV；

锥孔电压：负离子模式20V，正离子模式8V；

源温：150℃；雾化温度：500℃；锥孔气流速：150Lh；

雾化气流速：1000Lh

6 结果计算

采用单点内标法校正，按下式计算：

校正因子按下列公式计算

供试组织中氯霉素类药物及其代谢产物残留量按下列公式计算

计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。

7 结果

本方法中氯霉素在动物源食品中的检测限为0.1μg/kg，甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在动物源食品中的检测限为1μg/kg。本方法在0.2～10μg/kg添加浓度的回收率为70～120%。