NOD2致高同型半胱氨酸血症小鼠心室重构的作用及其机制

李香，秦咏，王维，苏红燕，曹晓青

(山东省胸科医院，济南250013)

临床研究显示，高同型半胱氨酸血症(hHcys)是心血管疾病及血管栓塞性疾病独立重要的危险因素[1,2]，血清同型半胱氨酸(Hcy)水平升高与慢性心力衰竭的发生以及严重程度有关[3,4]。hHcys能诱导心肌间质纤维化和血管周围纤维化，导致心肌硬度增加、心肌重构，进而诱发慢性心力衰竭。最近研究表明，内源性免疫系统在心血管疾病的发病机制中起着至关重要的作用[5]。先天免疫系统是机体防御病原体入侵的第一道防线，它通过特殊的模式识别受体感知病原相关分子模式和损伤相关分子模式来识别入侵的病原体。N样受体是模式识别受体家族中主要的受体，目前已发现22个N样受体成员，其中最有代表性的是核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)。研究发现，NOD2与糖尿病、肾缺血再灌注损伤、心肌梗死等多种疾病的发病机制有关[6～8]，NOD2可通过调节心肌细胞凋亡及炎症反应参与心肌缺血再灌注损伤。目前为止，hHcys所致心室重构的发生机制仍不清楚。为此，本文就NOD2在hHcys心肌组织中表达及其意义进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料 C57BL/6J野生雄性(WT)小鼠20只，体质量22～28 g，购自山东大学实验动物中心；胱硫醚β合酶(CBS)+/-鼠(CBS敲基因鼠，strain name:B6.129P2-Cbstm1Unc/J, stock number: 002853)、NOD2-/-鼠 (NOD2敲基因鼠，strain name: B6.129S1-NOD2tmlFlv/J, stock number: 005763)各20只，均购自美国Jackson实验室；7500多普勒超声心动图仪(美国飞利浦)，实时定量PCR仪(Bio-Rad，美国)，倒置相差显微镜及摄像系统(Olympus, 日本)。NOD2抗体(Protein Tech Group，美国)，基质金属蛋白酶9(MMP-9)抗体(Abcam，美国)，氯仿、异丙醇、100%乙醇(上海化学试剂有限公司，中国)，Trizol试剂(Invitrogen 生物有限公司，美国)。

1.2 动物饲养及建模 WT鼠、CBS+/-鼠、NOD2-/-鼠分别再分为正常饮食、无叶酸饮食各10只，饲养环境温度(24±2)℃，湿度(50±5)%，鼠房通风条件良好，喂养10周，建立hHcys小鼠模型。

1.3 超声心动图检测 喂养10周以后，小鼠经1.5%异氟烷吸入麻醉，用Philips 7500小动物超声系统进行经胸超声心动图检查，探头采样频率为12 MHz。由M型、二维、脉冲波多普勒和声学密度图像获得小鼠心脏舒张末期左心室内径(LVIDd)、收缩末期左心室内径(LVIDs)、左室舒张末期后壁厚度(LVPWd)、左室缩短分数(FS)、射血分数(EF)。

1.4 血清Hcy浓度检测 超声心动图检查后取小鼠心脏血0.5 mL，3 000 r/min离心15 min，取上清于-80 ℃保存，HPLC法检测血清Hcy浓度。然后将小鼠灌流至死，取心肌组织放于高压灭菌消毒的EP管或4%多聚甲醛中备用。

1.5 心肌组织NOD2 mRNA表达检测 取适量心肌组织按Trizol试剂说明书经两相分离、RNA沉淀、RNA清洗、重新溶解RNA沉淀等步骤提取总RNA；用反转录试剂盒将1 gRNA反转录为cDNA；取cDNA进行扩增，扩增体系为Tagmix 10 L、DDW 8 L、cDNA 1 L、引物1 L，其中NOD2 的上游引物是5’-CCTGGTACGTGCCCAAAGTAG-3’，下游引物是5’-GCCAAGTAGAAAGCGCAAA-3’；取8 L扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，照相于凝胶图像分析系统进行扫描，计算NOD2mRNA与GADPH mRNA比值。

1.6 心肌组织NOD2、MMP-9蛋白表达检测 取心肌组织20 g，剪碎后加入适量的蛋白裂解液(含1%PMSF)，冰上研磨，静置30 min，每10 min涡旋混匀1次。4 ℃ 12 000 r/min离心l0 min。吸取上清采用 BCA 法测定蛋白浓度。配置好相应的电泳胶，蛋白定量之后进行上样、电泳、转膜、封闭等步骤。封闭后加抗体4 ℃过夜，其中NOD2一抗浓度为1∶1 000、MMP-9一抗浓度1∶600。TBS-T 洗 3 次并加入二抗孵育 1 h 后，再次用TBS-T 洗 3 次。显影，扫描，应用IDImage Analysis Software分析表达强度。以目的蛋白与β-actin的光密度比值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.7 心肌组织免疫组化染色 将固定在4%多聚甲醛的心肌组织包埋、切片、脱蜡、水化后，PBS洗涤3 min×3次，高压修复，自然冷却至室温，PBS洗涤3 min×3次。用3%H2O2室温孵育10 min，PBS洗涤3 min×3次。滴加一抗NOD2(1∶200) 4 ℃过夜，PBS洗涤3 min×3次后滴加二抗室温孵育1 h。PBS洗涤，镜下二氨基联苯胺(DAB)染色。自来水冲洗，苏木素复染，盐酸-乙醇分化，氨水返蓝。梯度脱水，中性树胶封固，光学显微镜观察。

2 结果

2.1 hHcys小鼠心脏结构及功能变化 无叶酸饮食WT小鼠和CBS+/-小鼠血清Hcy浓度较正常饮食小鼠升高(P<0.05)，分别为正常饮食小鼠的2.1倍和4.5倍(图1A)。与正常饮食小鼠比较，hHcys WT小鼠和CBS+/-小鼠FS减小(图1B)，LVIDd、LVIDs增大(图1 C-D)，差异均有统计学意义(P均<0.05)。hHcys CBS+/-小鼠与同型WT小鼠比较，血清Hcy浓度升高、FS减小，LVIDd及LVIDs增大，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

注：control为正常饮食，FF为无叶酸饮食；A 小鼠血清Hcy；B小鼠心脏FS；C小鼠心脏LVIDs；D小鼠心脏LVIDd；与control比较，*P<0.05；与EF WT小鼠比较，#P<0.05。

图1 有无叶酸饮食WT 、CBS+/-小鼠血清Hcy浓度及心脏结构功能变化

2.2 hHcys小鼠心肌组织NOD2表达 hHcys WT小鼠和CBS+/-小鼠NOD2 mRNA、NOD2蛋白水平较正常饮食小鼠均上调，hHcys CBS+/-小鼠NOD2 mRNA、NOD2蛋白水平较同型WT小鼠上调(图2A、2B)，差异均有统计学意义(P均<0.05)。免疫组化染色NOD2在hHcys CBS+/-小鼠表达最强(图2C)。

注：control为正常饮食，FF为无叶酸饮食；A小鼠心肌组织NOD2 mRNA；B 小鼠心肌组织NOD2 蛋白；C小鼠心肌组织NOD2蛋白免疫组化染色；与control比较，*P<0.05 ；与EF WT小鼠比较，#P<0.05。

图2 有无叶酸饮食WT 、CBS+/-小鼠心肌NOD2表达

2.3 NOD2基因缺失对hHcys小鼠心脏结构及功能的影响 与正常饮食小鼠比较，无叶酸饮食WT、NOD2-/-小鼠血清Hcy水平升高，LVIDd增大，LVPWd、FS、EF减小，差异均有统计学意义(P均<0.05)。说明hHcys小鼠左室扩大，左室壁变薄，心功能降低。与WT hHcys小鼠比较，NOD2敲基因hHcys鼠左室扩大和室壁变薄现象减轻，心功能也有不同程度改善(P均<0.05)。见表1。

2.4 NOD2基因缺失后MMP-9蛋白表达变化 MMP-9在无叶酸饮食WT小鼠心肌组织中表达显著升高，而NOD2敲除后MMP-9表达降低(图3)。

3 讨论

Hcy是一种含硫氨基酸，它是蛋氨酸和半胱氨酸代谢的重要中间产物，也是能量代谢和许多需甲基化反应的中间产物。正常人空腹血中Hcy水平为5～15 mol/L，含量大于15 mol/L时称为hHcys。然而流行病学研究发现，当Hcy的血浓度大于6.3 mol/L时，就会迅速增加心脏疾病的发生危险[1]。hHcys与动脉粥样硬化和血栓发生密切相关，是心血管疾病、神经退行性病变及妊娠相关疾病的危险因素[9～11]。动物实验研究表明[3,12,]，高浓度的Hcy可致心脏血管周围和间质胶原增生，冠状动脉壁增厚，心肌肥大细胞，炎性细胞浸润，左室舒张压升高，导致心室重构和舒张功能下降。

表1 有无叶酸饮食WT 、NOD2-/-小鼠血清Hcy浓度及心脏结构功能比较

注：与正常饮食比较，*P<0.05 ；与无叶酸饮食WT小鼠比较，#P<0.05。

注：control为正常饮食，FF为无叶酸饮食；与control比较，*P<0.05 ；与EF WT小鼠比较，#P<0.05。

图3有无叶酸饮食及NOD2基因缺失小鼠MMP-9蛋白表达

造成hHcys的主要原因有：①富含甲硫氨酸饮食；②维生素(B12、B6、叶酸)缺乏；③Hcy代谢酶类基因改变，如CBS、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)等基因突变或缺失；④肾功能降低。另外，还有其他的遗传、生理、病理和营养因素都可引起Hcy升高，如高血压、糖尿病和素食等。CBS是Hcy转硫基化途径中重要的催化酶，其基因突变能干扰CBS亚单位与血红素和5-磷酸-吡哆醇的相互作用，从而使酶的活性降低或缺乏，进一步导致血浆Hcy水平升高[13]。CBS敲基因鼠是通过靶向删除CBS基因而产生的，本课题采用的CBS+/-小鼠在正常饮食条件下未产生hHcys，而用无叶酸饮食可以检测到较高的血浆Hcy水平，因此本课题hHcys动物模型采用无叶酸饮食方案。

研究表明[14]，Hcy能通过NMDA受体降低SERCA和肌集钙蛋白的表达，增加PLB表达，这可能诱导了心脏收缩舒张功能障碍。本研究采用WT小鼠、CBS+/-小鼠无叶酸饮食建立hHcys模型，显示hHcys WT小鼠和CBS+/-小鼠均出现心室重构及心脏功能异常。而且，hHcys WT小鼠和CBS+/-小鼠NOD2 mRNA、NOD2蛋白水平较正常饮食小鼠均上调，hHcys CBS+/-小鼠NOD2 mRNA、NOD2蛋白水平较hHcys WT小鼠上调，免疫组化染色NOD2在hHcys CBS+/-小鼠表达明显增强。

研究发现，NOD样受体可通过识别病原相关分子模式和损伤相关分子模式诱导炎症反应，NOD2/CARD15基因多态性对冠状动脉疾病的发生有重要影响[15]。Arg702Trp，Gly908Arg，Leu1007fsinsC是 NOD2/CARD15基因的3个单核苷酸多态性。Leu1007fsinsC多态性与临床上冠状动脉粥样硬化和冠状动脉斑块不稳定的风险增加有关，而GLY908ARG多态性则表现出对冠状动脉粥样硬化的保护作用。有研究者[16]在冠心病患者的斑块组织病变管腔侧的炎性细胞中检测到NOD2的表达。最近，liu等[17]研究表明，NOD2通过调节心肌细胞凋亡和炎症参与心肌缺血再灌注损伤。hHcys是心血管疾病的危险因素，NOD2在hHcys心肌组织中的表达及作用尚未见报道。为了进一步探讨NOD2是否在hHcys引起的心功能障碍和心室重构中发挥作用，我们选取NOD2敲基因鼠并建立hHcys模型，显示NOD2基因缺失能减弱hHcys引起的心室重构，小鼠心功能指标(EF、FS)在NOD2基因缺失后也得到不同程度的改善。

细胞外基质(ECM)的降解在左室重构中有重要作用。ECM是一个复合体，包含许多结构蛋白、信号分子和蛋白激酶。所有的ECM包含物都容易被MMPs蛋白酶水解，改变间质分子结构和生物活性的相互作用，因此MMPs决定着ECM的整个结构和功能。MMPs不仅能降解基质，也能调节胶原的合成，最终结果是MMPs表达升高的同时伴随纤维化的增多。大量研究发现，在心室重构期间，心肌MMP-9活性和表达都升高。MMP-9被认为是心室重构的一个潜在的生物标志物，它能降解胶原，引起ECM 退化，导致心肌排列紊乱，收缩功能异常。hHcys动物模型中MMP-9表达显著增加，并与炎症、细胞外基质降解和心脏功能失调有关[18]。大鼠喂以高蛋氨酸饲料8周后，血浆Hcy水平明显升高，同时血浆MMP-9及动脉MMP-9mRNA的表达明显增多，动脉损伤明显。本研究发现，hHcys大鼠心肌组织MMP-9表达显著升高，NOD2缺失后MMP-9表达下调，说明NOD2-MMP-9信号通路对hHcys小鼠心脏结构及功能有重要影响。

综述所述，NOD2在hHcys心肌组织中高表达，NOD2可能通过调控MMP-9的表达参与hHcys小鼠的心室重构过程。