人良性前列腺增生组织性激素相关受体ERα、ERβ、GPR30、AR的表达及其与前列腺增生的关系

褚靖，潘斌，黄鹏玉，叶啸，谢涛

(1暨南大学附属珠海医院，广东珠海519000；2暨南大学附属第一医院510630)

前列腺增生症是老年男性最常见的疾病，有超过90%的80岁以上男性会出现前列腺增生症状。老龄和有功能的睾丸是老年男性发生前列腺增生的基础，性激素水平紊乱是前列腺增生发生的必要条件。雌/雄激素两者协同作用，共同调控前列腺的发育和生理病理过程。雌激素作为男性体内另外一种重要的激素，与骨成熟、脂质代谢等密切相关。雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)是经典雌激素受体，它们定位于细胞核，与雌激素结合之后被激活，进而启动一系列与转录相关的反应。最近另外一种非核定位的非经典雌激素受体G蛋白偶联雌激素受体30(GPR30)被发现在心脏、大脑、肝脏以及卵巢等组织有表达。深入开展雌激素参与前列腺发育和增生的研究，有望能揭示前列腺增生的性激素调控本质。本文检测人良性前列腺增生组织和正常前列腺组织ERα、ERβ、GPR30、雄激素受体(AR)表达水平，以探讨ERα、ERβ、GPR30、AR在良性前列腺增生症发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 暨南大学附属珠海医院2016年7月～2017年7月收治住院前列腺增生患者48例(BPH组)，年龄(68.20±9.25)岁；患者均行经尿道前列腺电切术，术后病理明确诊断为良性前列腺增生组织。另选择同期行膀胱癌根治术患者19例(Normal组)，年龄(63.29±8.92)岁。两组年龄比较无统计学差异(P<0.05)。取良性前列腺增生组织标本及膀胱癌根治术患者病理诊断为正常前列腺组织标本进行检测分析，本研究获得医院伦理委员会批准及患者知情同意。

1.2 检测方法

1.2.1 检测试剂 Tris、SDS、甘氨酸为Sigma-Aldrich集团旗下品牌VETEC产品；飞克特超敏ECL液、SDS-PAGE凝胶快速配制剂盒均购自大连美伦生物技术有限公司；一抗兔ERα、ERβ、GPR30及AR多克隆抗体购于北京博奥森公司；羊抗兔二抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；DAB染色盒购于基因科技(上海)股份有限公司。

1.2.2 组织ERα、ERβ、GPR30、AR mRNA表达检测 采用Real-time PCR法。组织RNA按照TRIzol试剂说明书提取，并用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。引物由上海生工公司合成。各基因的引物序列如下: AR正链5’ - TTG GAT GGC TCC AAA TCA C-3’,反链5’- GCA ATG ATA CGA TCG AGT TCC -3’; ERα正链5’- TGG GCT TAC TGA CCA ACC TG - 3’, 反链5’- CCT GAT CAT GGA GGG TCA AA- 3’; ERβ正链5’- AGA GTC CCT GGT GTG AAG CAA - 3’, 反链5’- GAC AGC GCA GAA GTG AGC ATC- 3’；GPR30正链5’- TGGCACCCGACTAACCC - 3’, 反链5’- CACAGGAACCCTAAAGCAAA - 3’；β-actin正链5’- AGAGCTACGAGCTGCCTGAC - 3’, 反链5’- AGCACTGTGTTGGCGTACAG - 3’ 。取总RNA 1 μg，采用Toyobo的逆转录试剂盒进行逆转录翻译。反应条件如下：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 30 s,共40个循环。每个样本重复3次，统计并计算mRNA的表达量

1.2.3 组织ERα、ERβ、GPR30、AR 蛋白表达检测 采用Western blotting法。组织标本经常规研磨裂解离心变性制成样品蛋白提取液；按SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒说明书配胶，上样量10 μL，分级恒压电泳(80 V、20 min，120 V、90 min)，置于冰中100 mA恒流湿转60 min； 5%脱脂牛奶封闭液室温封闭1 h；随后滴加一抗4 ℃过夜；二抗37 ℃ 1 h；于暗房里滴加ECL发光液曝光，显影定影，保存结果。

2 结果

2.1 两组前列腺组织ERα、ERβ、GPR30、AR mRNA表达水平 Normal组ERβ mRNA水平与BPH组相比无统计学差异(P>0.05)；与Normal组相比，BPH组GPR30 mRNA水平降低(P<0.05)，ER α mRNA及AR mRNA表达水平上升(P均<0.05)。见图1、表1。

图1 两组前列腺组织ERα、ERβ、GPR30、AR mRNA表达电泳图及柱形图

2.2 两组前列腺组织ERα、ERβ、GPR30及AR的蛋白表达水平 Normal组前列腺组织ERβ蛋白表达水平与BPH组相比无统计学差异(P>0.05)；与Normal组比较，BPH组前列腺组织GPR30蛋白低表达(P<0.05)，ERα蛋白、AR蛋白表达水平上升(P均<0.05)。见图2、表2。

表1 两组前列腺组织ERα、ERβ、GPR30、AR mRNA表达比较

3 讨论

前列腺是一种性激素依赖的器官，而性激素有雄激素和雌激素，它们是通过其受体在前列腺的生长发育中发挥作用。因此，雌激素受体ERα、ERβ、GPR30及雄激素受体AR在BPH的发生发展中起着重要作用。当前人们基于整体的基因组、蛋白组、细胞与细胞相互作用的微环境水平对前列腺增生进行了多种研究。有学者采用高通量芯片和蛋白组学技术检测了临床前列腺增生样本的miRNA/mRNA表达谱和蛋白表达谱，首次构建了中国人种前列腺高通量数据集(miRNA、mRNA和蛋白)[1]。但是关于前列腺增生的病因学和病理生理学还不十分明确，其发病机制存在上皮-间质细胞学说、生长因子学说、激素-内分泌学说、细胞凋亡与基因调控学说等等多种假说。

图2 两组前列腺组织ERα、ERβ、GPR30、AR蛋白表达电泳图及柱形图

表2 两组前列腺组织ERα、ERβ、GPR30、AR蛋白表达比较

基于雄激素的作用机制，人们开发出了一系列治疗前列腺增生的临床药物。利用人为改变体内雌雄激素比例的方法，人们已经成功地在大鼠、狗等动物身上诱导了前列腺增生。研究发现，在前列腺内部雌雄激素比例的失调与前列腺细胞的增殖及凋亡有着非常密切的关系[2, 3]，雌激素与前列腺增生以及前列腺癌等疾病的发生关系密切[4, 5]。 研究发现，男性体内30%雌激素直接由睾丸产生，而70%是肾上腺和睾丸所产生的雄激素经芳香化酶作用转化合成的。老龄和有功能的睾丸是老年男性发生前列腺增生的基础。研究表明患有BPH的中老年男性，睾丸因老龄功能减退，导致雄激素水平下降，但雌激素保持原有水平或升高，由此雌/雄激素的比例增加[6]。雌/雄比例失调是前列腺增生的致病关键因素之一。

ERα主要分布在间质细胞中；ERβ则主要在上皮细胞中表达，在间质细胞中表达较低。ERα和ERβ虽在结构上具有高度相似，且在某些组织中共同表达，但是二者被激活之后所表现出来的反应却不同。ERα对前列腺间质细胞起增殖作用。雌激素能够通过前列腺间质细胞的受体，快速激活间质细胞中MAPK信号通道，从而促进前列腺的增生[7]。ERβ对前列腺上皮细胞的增殖分化产生作用。前列腺周带活检中获得的细胞在培养后发现ERβ mRNA的表达，但没有ERα mRNA的表达，认为雌激素是通过ERβ信号途径影响前列腺上皮细胞的生长[8]。前列腺基质细胞增生是BPH的主要类型，其占增生组织的60%左右[9]。本研究结果显示，ERα在BPH中表达水平与前列腺正常组织相比，表达含量明显增加；前列腺正常组织中的ERβ的表达水平与BPH相比无明显差异。证实ERα的表达水平与前列腺细胞增生速率的变化有关。在BPH中，ERα的过度表达可能是前列腺间质细胞加速增生的一个因素。

AR在上皮和间质细胞中均表达。AR是一种类固醇受体，在前列腺生长发育和调节分泌反应中起重要影响。雄激素能够通过AR介导刺激上皮和间质细胞的增殖，进而促进BPH的发生[10]。本研究结果表明，与前列腺正常组织相比，AR在BPH中为高表达。证实AR表达水平升高，促进前列腺增生，在BPH中，ERα和AR的高表达可能共同刺激前列腺细胞增生。GPR30主要在上皮细胞中表达。GPR30是G蛋白偶联受体超家族成员之一，雌激素可通过GPR30快速激活细胞内的第二信号系统，影响细胞生长发育状态。Yang等[11]认为抑制雌激素介导GPR30的细胞凋亡，从而使上皮细胞加速增殖，导致BPH的发生。本结果显示，与前列腺正常组织相比GPR30的蛋白表达水平在BPH中明显减少。证实BPH中雌/雄激素比例失调，GPR30表达水平下降，GPR30表达水平和BPH可能存在负向相关性。

本研究通过观察在前列腺正常组织和BPH中ERα、β，GPR30及AR的表达情况，推测雌/雄激素比例失调、ERα和AR表达水平升高、GRP30表达下降，可使前列腺细胞加速增殖，进而促进前列腺的增生。