miR-23b表达变化对脂多糖诱导巨噬细胞炎症反应的影响

郑俊雅，张珍，刘增瑞，李济君，李鲁新，初彦辉

(牡丹江医学院，黑龙江牡丹江157011)

微小RNA(miRNA)是一类高度保守的非编码小RNA，长度约22个核苷酸，它参与调控细胞增殖、胚胎发育、细胞凋亡和分化等众多生物学途径，并且与心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病及免疫系统疾病的发生和发展密切相关[1]。miR-23b是miRNA家族成员之一，与调控肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病、病毒感染等多种疾病的发生有关[2]，在调控机体炎症反应过程中同样发挥着重要作用。本课题组前期研究结果证实，细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)是miR-23b的靶基因[3]。ASK1作为c-Jun氨基末端激酶(JNK)及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)上游调节激酶，与炎症反应、细胞外基质重塑、肾间质纤维化和细胞凋亡的调控密切相关[4]。miR-23b可抑制p38 MAPK-NF-κB炎症信号通路的活性，减轻巨噬细胞浸润。白介素17(IL-17)可下调人成纤维细胞样滑膜细胞、小鼠肾原代细胞和星形胶质细胞中miR-23b的表达；反之，miR-23b可抑制IL-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)介导的核转录因子κB(NF-κB)的活化和炎症因子表达，从而抑制自身免疫性炎症。但miR-23b是否直接参与到脂多糖(LPS)介导的巨噬细胞炎症反应的调控目前尚不清楚，有待进一步阐明。2018年4月～2019年1月，本研究观察了miR-23b表达变化对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 小鼠巨噬细胞株J774A.1购自上海酶联生物科技有限公司。胎牛血清购于美国Gibco公司。DMEM培养基购于美国Sigma-Aldrich公司。LPS购于Sigma公司。LipofectamineTM2000转染试剂购于Invireogen公司。miR-23b类似物(miR-23b mimics)及miR-23b抑制剂(miR-23b inhibitor)均购于广州锐博生物科技有限公司。RNA提取试剂盒购于Omega公司。逆转录试剂盒购自Roche公司。引物购于上海生工生物工程有限公司。IKKα抗体购自碧云天生物技术有限公司。β-actin抗体购自Cell Signaling公司。

1.2 LPS作用浓度筛选 用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于5% CO2、37 ℃条件下培养J774A.1细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代。将细胞接种于6孔板，分别给予0、0.1、0.5、1、5、10 μg /mL的LPS处理12 h。光镜下观察细胞形态，不同浓度LPS处理的J774A.1细胞均出现显著的活化形态特征，即细胞体积增大、胞突伸展、出现伪足。采用qPCR方法检测细胞中的炎症相关因子NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA，0.5、1、5、10 μg /mL的LPS处理的细胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量高于未经LPS处理的细胞(P均<0.01)。见表1。Western blotting法检测IKKα蛋白，0.1、0.5、1、5、10 μg/mL的LPS处理的细胞中IKKα蛋白相对表达量高于未经LPS处理的细胞(分别为1.54±0.06、3.10±0.26、3.27±0.21、2.82±0.17、2.25±0.24、1.03±0.03，P均<0.01)。选择1 μg/mL为LPS的适宜作用浓度。

表1 不同浓度LPS处理后巨噬细胞中p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达比较

注：与0 μg/mL LPS相比，*P<0.05，**P<0.01。

1.3 巨噬细胞分组及miR-23b类似物、抑制剂转染 将巨噬细胞分为miR-23b mimics组、阴性对照1组和miR-23b inhibitor组、阴性对照2组，接种于6孔板。将miR-23b mimics、miR-23b inhibitor、mimics control、inhibitor control的冻干粉分别用无RNase水溶解。加入2.5 μL的LipofectamineTM2000到100 μL无血清DMEM培养基中，轻弹混匀后室温静置5 min，分别加入miR-23b mimics、mimics control和miR-23b inhibitor、inhibitor control，混匀后于室温条件下静置25 min。各组细胞换成2 mL新鲜无血清DMEM培养基，之后分别加入提前配置的相应转染液，试剂终浓度为50 nmol/L。将6孔板放到细胞培养箱中，转染3 h后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，并加入1 μg/mL的LPS继续培养12 h，收集上清液及细胞备检。采用qPCR检测各组细胞中的miR-23b，miR-23b mimics组、阴性对照1组和miR-23b inhibitor组、阴性对照2组miR-23b相对表达量分别为5.56±0.41、1.04±0.02和0.36±0.03、1.02±0.03。miR-23b mimics组miR-23b表达水平高于阴性对照1组，miR-23b inhibitor组miR-23b表达水平低于阴性对照2组(P均<0.01)，表明miR-23b mimics、miR-23b inhibitor均转染成功。

1.4 巨噬细胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA检测 采用qPCR法检测各组细胞中的NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA。细胞总RNA的提取按照RNA提取试剂盒操作说明进行，用Nanodrop 2000测定总RNA纯度和浓度。取A260/A280为1.8～2.0的RNA样品进行逆转录。逆转录反应按照逆转录试剂盒操作说明进行，以合成后的cDNA作为模板，进行PCR反应。PCR反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 34 s、共40个PCR循环。以β-actin为内参。以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。相关基因引物序列见表2。

表2 NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6基因及内参基因引物序列

2 结果

miR-23b mimics组细胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量低于阴性对照1组(P均<0.01)。见表3。miR-23b inhibitor组细胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量高于阴性对照2组(P均<0.01)。见表4。

表3 miR-23b mimics组、阴性对照1组细胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达比较

注：与阴性对照1组相比，*P<0.01。

表4 miR-23b inhibitor组、阴性对照2组细胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达比较

注：与阴性对照2组相比，*P<0.01。

3 讨论

炎症反应的实质是机体组织受外界刺激时所产生的一种保护性应答反应，同时伴随着促炎因子的释放[5]。正常情况下，机体内的促炎细胞因子与抗炎细胞因子共同调节炎症反应，使机体免疫防御功能得以稳定。巨噬细胞属于机体免疫细胞的一种，当机体受到损伤时，巨噬细胞会快速且非特异性地对损伤作出反应，这对于激活机体固有免疫和获得性免疫都是非常重要的[6]。巨噬细胞在炎症反应调控过程中发挥至关重要的作用，是自身免疫和自身炎症性疾病中炎症介质的主要产生者。巨噬细胞分泌炎症因子参与介导多个系统炎症反应的发展；巨噬细胞还与肿瘤的发生发展密切相关[7～9]。

LPS是一种革兰阴性菌的表面抗原物质，是多种噬菌体吸附的受体，能够激发机体的炎症反应，诱发临床内毒素血症的产生[10]。LPS诱导的炎症反应主要由Toll样受体4(TLR4)介导，TLR4被激活后通过与分子伴侣热休克蛋白60结合，激活NF-κB，诱导单核-巨噬细胞并产生相应的炎症因子[11]。LPS模型是经典的炎症模型。LPS刺激靶细胞后，通过NF-κB介导促炎症基因细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达上调，ICAM-1又可反过来调节NF-κB的表达，从而使炎症信号和炎症因子被持续激活和释放[12]。

miRNA是一类能够在转录后水平调控基因表达的小分子。miRNA可以参与调节多种信号通路，在细胞的增殖、凋亡、分化及细胞黏附等多方面均能发挥重要作用[13,14]。有报道指出，miR-23b在自身免疫疾病中表达下调，被认为可能是炎性疾病的治疗靶点。miR-23b可通过调节炎症因子的途径调控多种自身免疫性疾病，影响炎症因子如NF-κB、TNF-α、IL-17等的产生。在免疫性炎症疾病中，miR-23b通过靶向调节NF-κB下游信号通路中的关键信号分子TGF-β活化激酶结合蛋白2、TGF-β活化激酶结合蛋白3、IKKα等抑制IL-17/TNF-α诱导的NF-κB的活化和炎症因子表达[15]。miR-23b不仅可以通过抑制IL-17产生，参与相关自身免疫性炎症的发生，还可抑制Th1、Th17向中枢神经系统迁移，抑制自身免疫性脑脊髓炎的病程[16]。miR-23b已被证明能够抑制感染性疾病中的炎症反应，并可在脓毒性休克期间抑制血管内皮功能[17]。研究报道，抑制miR-23b表达可显著改善心脏功能，有助于减轻脓毒症后期心肌纤维化的激活[18]。近期研究发现,miR-23b可通过减轻炎症反应治疗败血症诱发的心肌病，其作用机制可能是miR-23b抑制NF-κB激活，降低TNF受体关联因子6和IKKβ表达水平，减少细胞凋亡。上述研究结果表明miR-23b有望为脓毒症引起的心肌病的治疗提供新的方向。

本课题组前期研究结果证实，miR-23b可能是一种有效的皮肤伤口愈合剂，其可以靶向细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)抑制炎症反应，缩短炎症反应周期，促进皮肤伤口愈合。多种应激损伤及促炎因子均可激活ASK1，而活化的ASK1又可激活MKK3/MKK6-P38及MKK-4/MKK7-JNK激酶途径，进而对下游p38 MAPK及JNK信号通路进行调控，对MAPK激酶3和MAPK激酶4做出免疫应答，导致促纤维化和促炎因子的产生[19]。有研究表明，miR-23b可抑制p38 MAPK-NF-κB炎症信号通路活性，减少巨噬细胞的浸润及炎症因子TNF-α、IL-6的表达，减轻肾组织的炎症性损伤[20]。因此我们推测miR-23b可能参与调控巨噬细胞介导的炎症。本研究结果显示，miR-23b mimics组细胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量低于阴性对照1组，miR-23b inhibitor组细胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量高于阴性对照2组。上述结果表明，LPS可显著诱导巨噬细胞活化，诱导包括TNF-α、IL-1β、IL-6在内的炎症因子分泌；而miR-23b可以在一定程度上抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应，降低相关炎症因子的表达。抑制miR-23b可以导致LPS诱导的炎症反应细胞中炎症因子表达增加。miR-23b可能在机体免疫反应过程中起到一定调节作用，具体的机制和涉及的信号通路仍有待进一步研究。