原发性皮肤恶性黑色素瘤相关miRNA筛选及其靶基因的生物信息学分析

李慧，王柯

(1河南省人民医院河南大学临床医学院，郑州450003；2郑州大学人民医院；3郑州大学附属洛阳市中心医院)

皮肤恶性黑色素瘤极具侵袭性且易转移，预后极差。手术切除是其惟一治愈方式，其他治疗手段的失败提示学者们对黑色素瘤发病的分子机制仍知之甚少，因此有必要更全面地了解黑色素瘤的转录图谱和信号转导通路。miRNA是内源性非编码小RNA总称，可调控基因表达、参与肿瘤发生发展[1]。因此，miRNA有望作为多种疾病诊断或治疗的靶点。GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[2]由美国国家生物技术信息中心(NCBI)于2000年创建，覆盖疾病、代谢、药理学等方面生物学内容。2019年3月，本研究从GEO数据库中筛选所需数据，筛选原发性皮肤恶性黑色素瘤相关miRNA及其靶基因，并进行生物信息学分析，旨在为原发性皮肤恶性黑色素瘤的深入研究提供一定线索和帮助。

1 材料与方法

1.1 基因芯片来源 本研究中涉及的基因芯片平台为GPL15019(Agilent-031181 Unrestricted_Human_miRNA_V16.0_Microarray 030840)和GPL15183(CRUK/Melton lab-Human melanoma-71-v2-miRNA expression profiling)。详见网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi acc=GPL15019和https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi acc=GPL15183。

1.2 差异表达miRNA筛选 经检索，符合本研究对象的数据集包括GSE34460和GSE35579;进入GEO2R(GEO数据库自带数据分析工具)页面(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi acc=GSE34460)，并选择项目“Analyze with GEO2R”，点击“Define groups”对皮肤恶性黑色素瘤组织和皮肤良性黑素细胞痣组织进行分组，选择“Save all results”并保存至TXT文档。将该TXT文档以Excel方式打开后，筛选同时满足adj.P<0.01和|logFC|>1者[3]，其中logFC>1者为在恶性黑色素瘤组织中相对良性黑素细胞痣组织中表达上调的miRNA，而logFC<-1者为在恶性黑色素瘤组织中相对良性黑素细胞痣组织中表达下调的miRNA。同样方法筛选出GSE35579中差异表达miRNA，并与GSE34460中差异表达miRNA分别取交集，得到二者共同差异表达的miRNA[3]，以行进一步分析。

1.3 差异表达miRNA靶基因预测 借助miRecords(http://c1.accurascience.com/miRecords/)平台[4]预测差异表达miRNA的靶基因。为降低软件预测假阳性，拟定至少同时在5个预测软件中均有记录的基因才可作为靶基因[1]。

1.4 差异表达miRNA靶基因功能注释及通路分析 以用于注释、可视化和集成发现的数据库DAVID6.8工具(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)为分析平台，利用“Annotation summary results”中的“Gene Ontology”和“Pathways”功能，对皮肤恶性黑素瘤中差异表达miRNA的靶基因分别进行基因本体论数据库(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)分析，其中P<0.05提示结果差异有统计学意义[3]。

1.5 miRNA靶基因编码蛋白相互作用网络的构建及分析 将皮肤恶性黑素瘤的差异表达miRNA的靶基因导入STRING在线分析软件(http://string.embl.de/)，获得靶基因编码蛋白网络图，将独立节点删除后，绘制差异表达靶基因编码蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图。再将上述STRING数据库中PPI网络图数据以TSV格式导出，导入Cytoscape3.4.0软件[5]，并通过“Molecular Complex Detection(MCODE)”工具对PPI网络进行聚类分析。根据相关文献设置标准[6]，分析完毕后，状态为“seeds”的对应基因即为核心基因，MCODE得分≥3且结点数≥4的聚类为关键聚类。

1.6 以核心基因为靶点的化合物筛选 在比较毒物遗传学数据库中筛选能影响核心基因的化合物[7]，数据库网址为http://ctd.mdibl.org/。

2 结果

2.1 皮肤恶性黑素瘤差异表达miRNA GSE34460芯片中共13个差异表达miRNA，GSE35579芯片中共70个差异表达miRNA；两组芯片中共同差异表达miRNA共5个，且均表达下调，分别为hsa-miR-183、hsa-miR-200a、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-204、hsa-miR-429(P分别为4.04E-06、1.21E-05、6.02E-05、6.05E-03、4.38E-02)。

2.2 差异表达miRNA靶基因预测 hsa-miR-183的靶基因包括IRS1、SCYL3、DCX、SMPD3、SOCS6、SLITRK1、CNTNAP2、FOXO1、MAP3K4等。hsa-miR-200a的靶基因包括ZEB2、CHP、RARB、NAP5、TMEM110、WDFY3、ZNF644、EXOC5等。hsa-miR-455-5p的靶基因包括CACNB4、TAF4、USP9X、HTR2C、TMEM30A、BRD1、NR4A2、DYNC1LI2及C4orf17等。hsa-miR-204的靶基因包括PLAG1、RPS6KC1、EFNB3、ESRRG、MON2、RSPO3、FAM134C、YARS及CHN2等。hsa-miR-429的靶基因包括LRP1B、FAM8A1、KIAA0355、OLIG3、REEP1、SNAP25、AFF3、GPM6A及AP1S2等。

2.3 差异表达miRNA靶基因功能注释及通路分析 hsa-miR-183靶基因主要存在于胞质，参与蛋白质去磷酸化、多巴胺能神经突触相关信号通路等。hsa-miR-200a靶基因主要存在于胞质，具有正性调节RNA聚合酶Ⅱ启动子、结合Ephrin受体等作用。hsa-miR-204靶基因主要存在于胞质囊泡膜，参与调节RNA聚合酶Ⅱ启动子、雌激素信号通路等。hsa-miR-429靶基因主要位于胞质，可负性调控细胞迁移、参与卵母细胞减数分裂等。hsa-miR-455-5p靶基因主要位于胞质，参与心肌细胞中肾上腺素能信号传导、Hippo信号通路等。详见表1～5。

表1 hsa-miR-183靶基因基因功能及通路富集分析结果

表2 hsa-miR-200a靶基因基因功能及通路富集分析结果

表3 hsa-miR-204靶基因基因功能及通路富集分析结果

表4 hsa-miR-429靶基因基因功能及通路富集分析结果

表5 hsa-miR-455-5p靶基因基因功能及通路富集分析结果

2.4 差异表达miRNA靶基因编码蛋白PPI网络的构建及分析 hsa-miR-183靶基因编码蛋白的PPI网络图由144个节点构成，连接度为84；核心基因分别为PPP2CB、PLCB4、RNF138、GATAD2B，关键聚类为PPP2CA、PPP2CB、PPP2R5C、PPP2R2A。hsa-miR-200a靶基因编码蛋白的PPI网络图由127个节点构成，连接度为95；核心基因为TMEM110，但无符合条件的聚类。hsa-miR-455-5p靶基因编码蛋白的PPI网络图由105个节点构成，连接度为40；MCODE分析显示仅有2个结点，无法分析核心基因。hsa-miR-204靶基因编码蛋白的PPI网络图由245个节点构成，连接度为274；MCODE分析显示仅有4个结点，无法分析核心基因。hsa-miR-429靶基因编码蛋白的PPI网络图由20个节点构成，连接度为1；核心基因为CLASP2，但无符合条件的聚类。经Cytoscape平台分析得到，皮肤恶性黑色素瘤差异表达miRNA靶基因编码蛋白PPI网络的核心基因为PPP2CB、PLCB4、RNF138、GATAD2B、TMEM110和CLASP2。

2.5 以核心基因为靶点的毒物筛选 砷剂和二嗪农均可影响PPP2CB基因甲基化，其中二嗪农主要表现为促进作用。氯化镉可抑制PPP2CB、TMEM110启动子甲基化。黄曲霉毒素B1可抑制GATAD2B、CLASP2甲基化。三氯乙烯可以促进CLASP2甲基化。因此，以核心基因为靶点的毒物主要通过影响基因甲基化发挥作用。

3 讨论

随着分子生物学技术的发展，微阵列芯片技术在生物学研究中占有重要地位。基因芯片的广泛应用产生了海量的数据。通过挖掘数据库中的数据，再用整合或对照研究等方法挖掘基因或非编码RNA之间的关联信息，继而揭示基因或非编码RNA之间复杂的作用机理是一种非常值得尝试的研究策略。目前常用的基因信息数据库包括TCGA和GEO。本研究所使用的筛选差异miRNA的工具为GEO数据库自带的GEO2R在线分析工具。此外本研究也使用了DAVID、STIRNG和Cytoscape等工具。

目前关于原发性皮肤恶性黑色素瘤的研究非常多，但人们对该疾病的认识仍不够全面。本研究从GEO数据库中筛选所需数据并借助GEO2R等多种分析工具进行了一系列生物信息学分析，最终得到原发性皮肤恶性黑素瘤组织中差异表达的miRNA靶基因中的核心基因和关键聚类。本研究结果显示，GSE34460和GSE3557两组芯片中共同差异表达miRNA共5个，分别为hsa-miR-183、hsa-miR-200a、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-204和hsa-miR-429，均表达下调。差异表达miRNA的靶基因主要参与蛋白质去磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ启动子调节、结合Ephrin受体、细胞迁移调控、卵母细胞减数分裂、心肌细胞中肾上腺素能信号转导等过程，涉及通路包括多巴胺能神经突触相关信号通路、雌激素信号通路、Hippo信号通路等。经Cytoscape平台分析得到皮肤恶性黑色素瘤差异表达miRNA靶基因编码蛋白PPI网络的核心基因为PPP2CB、PLCB4、RNF138、GATAD2B、TMEM110和CLASP2。上述核心基因相关的毒物包括砷剂、二嗪农、氯化镉、黄曲霉毒素B1、三氯乙烯，主要以影响基因甲基化发挥毒性作用。

2A型蛋白磷酸酶(PP2A)是体内主要的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，主要参与减数分裂、有丝分裂、精子获能、细胞凋亡等过程，可调控基因转录和生长因子信号转导[8]，并且可能具有肿瘤抑制因子的功能。α异构体(PPP2CA)和β异构体(PPP2CB)是PP2A的催化亚基[9]，PPP2CA在恶性黑色素瘤中具有抗凋亡活性[10]。PPP2R5C和PPP2R2A是PP2A的调节亚基，PPP2R5C主要通过对P53蛋白某些位点氨基酸去磷酸化而实现调节细胞增殖和分化的作用[11]。与良性色素痣相比，PPP2R5C在恶性黑色素瘤中表达下调[8]。而PPP2CB及PPP2R2A与恶性黑色素瘤的关系尚未见文献报道。

已有研究报道PLCB4在皮肤恶性黑色素瘤中突变率为21%～28%[12]，可能具有抑癌基因活性。深度测序分析还发现PLCB4基因突变在眼色素层恶性黑色素瘤[12]以及脑膜恶性黑色素瘤[13]的形成中具有重要作用，但具体机制尚未明确。RNF138是E3泛素化连接酶，被其锌指结构介导募集至DNA损伤位点并泛素化关键修复因子，促进同源重组修复[14]。由RNF138介导的RAD51D泛素化可促进DNA交联损伤修复[15]、同源重组修复[16]和染色体完整性[15]，UBE2D-RNF138-CtIP轴也可促进DNA损伤修复[17]。但RNF138与恶性黑色素瘤的关系尚未见文献报道。

GATAD2B是甲基化-CpG结合蛋白-1复合体(MECP1)的亚基，它可以去乙酰化甲基化核小体和抑制转录活性。GATAD2B可能与硬脑膜形成[18]和妊娠、分娩[19]有关。TMEM110是一种跨膜蛋白，它可通过STIM-ORAI信号通路调节内质网-胞质膜连接及其生理学重构[20]。CLASP2可调节细胞损伤和细胞周期，在大脑皮层发育中负责协调Reelin通路功能和细胞骨架形成[21]。GSK3可介导CLASP2磷酸化继而调节着丝粒[22]。可见，TMEM110和CLASP2均与细胞结构有关，但二者与恶性黑色素瘤的关系尚未明确。

考虑目前基因芯片及高通量测序等测序技术的经济成本较高，本研究通过筛选GEO数据库中的资料进行二次分析，所得结果与真实情况难免有一定差异，上述分析结果未来仍需在实验室中进一步验证。