泊洛沙姆188对大鼠心肌缺血再灌注损伤的干预作用及其机制

潘雨薇，杨毓雯，黎昱材，罗琼，柳建华

(1广州医科大学附属市一人民医院，广州510180；2华南理工大学附属第二医院)

缺血性心脏病是中高收入国家第一大致死性疾病。近几十年来，溶栓治疗、经皮冠状动脉成形术和冠状动脉旁路移植术等措施在恢复患者心肌灌注方面起到良好效果。然而，恢复血供后有时会出现缺血部位结构损伤和代谢障碍加重的现象，该现象被称为心肌缺血再灌注损伤(MIRI)[1]。MIRI的基本特点包括：损伤的最终关键部位不是血细胞或血管壁，而是心肌细胞；损伤部位的病理改变伴随着细胞膜的破裂；缺血再灌注损伤主要集中在再灌注开始后的前几分钟[2]。缺血再灌注诱导Ca2+爆发式释放、活性氧大量生成和线粒体通透性转换孔的开放[3～5]。上述过程可对细胞膜产生破坏，其损伤作用包括细胞膜磷脂减少，细胞膜脆性增加，细胞膜上结合的酶活性下降，新的膜离子通道形成，使膜脂质和蛋白质之间、蛋白质和蛋白质之间相互交联或聚合，从而促进膜损伤、膜脂质过氧化、磷脂酶活化及脂质三联体对膜结构的破坏[6]。以上提示保护细胞膜可能是从下游减轻MIRI的方法之一。泊洛沙姆作为一类表面活性剂，是含有两个聚氧乙烯和一个聚氧丙烯的非离子型三嵌段共聚物。其中泊洛沙姆188(P188)被认为具有较高安全性，同时它也是一种膜密封剂。既往研究显示，P188能与二棕榈酰磷脂酰胆碱和二棕榈酰磷脂酰甘油特异性结合，促进受损细胞膜的愈合[7]；P188也能显著减轻细胞膜孔扩大，抑制碘化丙啶内流[8]。目前，使用膜密封剂来减轻MIRI的相关研究较少。2017年3月～2019年1月，本研究观察了P188对大鼠MIRI的干预作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 实验动物：SPF级雄性SD大鼠15只，体质量(250±20)g，购自广东省医学实验动物中心。细胞：新鲜SD大鼠尾静脉血红细胞。主要仪器：Logiq E9超声影像系统、ALC-V9小动物呼吸机、BL-420生理记录仪。主要试剂：戊巴比妥钠、P188标准品、2,3,5-三苯四唑氯铵(TTC)、伊文思蓝(EB)、大鼠超敏心肌肌钙蛋白I(hs-cTnI)ELISA试剂盒、脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿苷缺口末端标记(TUNEL)凋亡试剂盒。本实验方案经华南理工大学实验动物伦理委员会批准(伦理编号2018027)。

1.2 P188对大鼠MIRI的干预作用观察

1.2.1 MIRI模型建立及P188干预 15只大鼠随机分为假手术组(SHAM组)、生理盐水组(NS组)和P188组，每组5只。SHAM组仅开胸不进行冠状动脉左前降支结扎。在NS组和P188组大鼠左心耳下方2 mm水平处用6-0缝线暂时性结扎左前降支使心肌变白、心电图Ⅱ导联ST-T段抬高。缺血30 min后，P188组经尾静脉注射15%的P188 250 mg/kg。NS组给予等量生理盐水。随后解开结扎处恢复灌注。以结扎水平下的心肌变白、心电图ST-T段升高判定为MIRI模型制作成功。

1.2.2 心功能评价 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，进行超声心动图检查。采用M模式，分别于结扎术前和再灌注2 h后记录左心室缩短率(FS)和射血分数(EF)，计算术后与术前FS、EF的差值ΔFS、ΔEF。

1.2.3 心肌损伤标志物检测 按ELISA试剂盒说明书操作，测定大鼠血浆hs-cTnI。

1.2.4 心肌组织观察及梗死区与风险区面积比测定 维持麻醉，原位结扎大鼠心脏的左前降支。取大鼠动脉血3 mL置于肝素管中，左心室注射1.5%的EB 3 mL，静置4 min。处死大鼠，取心脏速冻后切成5～6块约2 mm厚的切片并将其浸泡于37 ℃的3% TTC中20 min。将心脏切片放入10%的中性甲醛溶液中固定15 min，拍照后用Image Pro Plus 6.0软件分割图像并计算梗死区与风险区面积比[9]。

1.2.5 心肌细胞凋亡率测算 将大鼠心脏切片，进行TUNEL染色，将切片脱蜡、修复、破膜后，加入末端脱氧核苷酸转移酶和鸟苷三磷酸的混合物。孵育后，用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行复染后封片。DAPI染色的细胞核在紫外光的激发下呈蓝色，凋亡细胞核呈绿色。在荧光显微镜下采集图像。采用Image Pro Plus6.0软件分析并计算免疫荧光图像中的凋亡细胞数和总细胞数。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数。

1.3 P188的细胞膜保护作用观察

1.3.1 细胞分组及给药方法 将大鼠尾静脉血红细胞分为7组，分别与PBS、不同浓度(1.88%、3.75%、7.5%、15%)的P188溶液、1%曲拉通X-100(Triton-X 100，一种经典的快速裂解细胞组织的强破膜剂)溶液、含15% P188与1% Triton-X 100的混合溶液(即Triton+P188)共孵育。

1.3.2 相对细胞膜破裂率计算 各组红细胞与200 μL对应溶液在37 ℃恒温振荡箱中共孵育2 h，震荡速度75次/min。离心后在541 nm波长下测定上清液的光密度(OD)值，计算相对细胞膜破裂率。

1.3.3 细胞形态观察 各组红细胞孵育2 h或12 h后在倒置显微镜下观察拍照，观察细胞形态。正常红细胞在光镜下可表现出良好的折光性。

2 结果

2.1 P188对大鼠MIRI的干预作用

2.1.1 各组大鼠心功能比较 NS组与P188组干预后均发生不同程度的左心室运动减弱。NS组、SHAM组、P188组ΔFS分别为-15.2%±4.4%、-0.2%±0.8%、-5.4%±4.3%，ΔEF分别为-14.4%±4.7%、-0.2%±0.8%、-4.7%±3.9%。NS组ΔFS、ΔEF低于SHAM组(P均<0.05)，但P188组与NS组、SHAM组差异无统计学意义。见图1。

图1 各组大鼠超声心动图表现

2.1.2 各组大鼠心肌损伤标志物水平比较 NS组、SHAM组、P188组大鼠血浆hs-cTnI水平分别为(640.8±60.6)、(302.4±42.1)、(460.7±25.9)pg/mL，P188组、SHAM组血浆hs-cTnI水平均低于NS组(P均<0.05)。

2.1.3 各组大鼠心肌梗死区与风险区面积比比较 各组大鼠心肌组织切面见图2。P188组、NS组、SHAM组梗死区与风险区面积比分别为0.12±0.03、0.43±0.08、0，P188组梗死区与风险区面积比低于NS组(P<0.05)。

图2 各组大鼠心肌组织切面

2.1.4 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较 NS组、SHAM组、P188组大鼠心肌细胞凋亡率分别为73.8%±5.9%、4.4%±1.6%、41.0%±7.1%，P188组、SHAM组心肌细胞凋亡率均低于NS组(P均<0.05)。

2.2 P188对红细胞膜的保护作用

2.2.1 各组红细胞相对细胞膜破裂率比较 15%及更低浓度的P188对细胞膜无明显损伤。孵育2 h后，不含Triton的各组红细胞基本未见破坏，Triton组红细胞膜破坏最严重，Triton+P188组红细胞膜破坏较轻。详见图3。PBS组、1.88% P188组、3.75% P188组、7.5% P188组、15% P188组、Triton组、Triton+P188组相对细胞膜破裂率分别为0、-0.3±0.1、-0.3±0.0、3.4±0.0、11.2±0.8、100.0±0.0、6.5±0.1，孵育2 h后1.88% P188组、3.75% P188组、7.5% P188组、15% P188组、Triton+P188组相对细胞膜破裂率均低于Triton组(P均<0.05)。

注：A1～7分别为PSB组、1.88% P188组、3.75% P188组、7.5% P188组、15% P188组、Triton组、Triton+P188组。

图3 各组红细胞膜破裂情况

2.2.2 各组红细胞形态变化 孵育2 h后，不含Triton的各组均可见折光性好的完整细胞，Triton组未见完整细胞，Triton+P188组仍可见完整细胞。孵育12 h后，Triton+P188组中观察不到完整的细胞，而PBS组仍能观察到完整细胞。见图4。

注：A1～7分别为PBS组、1.88% P188组、3.75% P188组、7.5% P188组、15% P188组、Triton组、Triton+P188组孵育2 h后细胞形态；A8、A9分别为Triton+P188组、PBS组孵育12 h后细胞形态。

图4 各组红细胞形态变化

3 讨论

细胞膜损伤是MIRI的重要机制之一，既往研究显示P188可以帮助骨骼肌细胞在氧化环境中保持完整性，也可以作为细胞保护剂被加入到细胞培养基[10]。既往研究采用15%、250 mg/kg的P188进行体内研究[11]，本研究在体内沿用该P188浓度，另于体外实验中设不同浓度组进行探究。本研究结果显示，P188组心肌组织梗死区与风险区面积比、心肌细胞凋亡率及血浆hs-cTnI水平均低于NS组，表明P188有助于减轻大鼠MIRI，降低了缺血心肌细胞在再灌注过程中转向死亡的可能。正常情况下，大部分线粒体通透性转化孔(mPTP)关闭。当线粒体钙超载时，线粒体膜电位降低，mPTP打开，导致线粒体膜通透性增加，加速线粒体凋亡相关因子的释放，导致含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)依赖性和非Caspase依赖性细胞死亡。有研究表明，P188可降低Caspase-8、细胞色素C、Caspase-9的表达及凋亡执行因子Caspase-3的表达[12]。P188有可能通过调节凋亡相关因子的表达从而减轻MIRI[12,13]。不同于细胞凋亡率或梗死区与风险区面积比，左心室心肌运动功能只有在心肌细胞功能显著改善时才会发生明显改变。本研究中，NS组与P188组ΔFS、ΔEF差异无统计学意义，暂无充分证据表明P188有改善心功能的作用，这可能与样本量、选用的方法或其他原因有关[11,14]。

为进一步探讨P188的作用机制，本实验还观察了P188对大鼠红细胞膜的保护作用。已知P188通过进入细胞膜破裂处的外围部分来修复细胞膜,这种现象以往只在模拟的生物膜中观察到[7,15]。我们的实验在细胞水平证实了P188可以直接使细胞抵抗强破膜剂的短期破坏作用。这种膜密封特性可能与P188特定的理化参数有关，如临界胶束浓度、亲水亲脂平衡、表面活性剂膜/水分配系数或填料参数等，尤其是临界胶束浓度。本研究中，在P188中孵育的红细胞与PBS组的红细胞表现相似，表明P188作用温和，对细胞膜不会产生显著损伤，不会引起明显的细胞死亡。破膜剂TritonX-100作用迅速，可在数秒内使几乎所有的细胞膜发生破裂。P188的机械作用能够使红细胞在破膜剂孵育2 h后仍保持正常形态，这是由于P188的聚氧乙烯嵌段能投射到脂质双分子层两侧的水道中，帮助修复膜屏障。然而，在含P188与Triton X-100的溶液中孵育12 h后，镜下观察未见完整红细胞，则表明P188修复破裂的细胞膜的能力是有限的，P188不能维持发生持续损伤的细胞膜的完整性。当细胞膜产生的孔洞较小、直径在0.2 μm以下时，细胞膜的脂质双分子层的断裂端可在自由能作用下再次融合，细胞膜因此修复。当细胞膜产生的孔洞较大时，需要激活细胞内源性的修复机制，胞内小囊在肌球蛋白与驱动蛋白的作用下转移到细胞膜缺损处，进行细胞膜修复。当细胞膜破裂过大时，P188无法通过单纯的机械作用来修复细胞膜，最终导致细胞膜损伤。

P188是一种可静脉注射材料，具有高度的生物相容性，能防止被巨噬细胞摄取，待生物膜愈合后还可被“挤出”膜结构[16]。P188在眼组织、生殖系统和肝脏中应用具备一定的安全性。在体内，P188浓度较高的组织依次为肾脏、淋巴结、肝脏、脾脏、膀胱和胃肠道。在大鼠、狗和人体内，P188的清除几乎完全是通过肾脏以原型排出[17～20]。我们发现，P188可导致大鼠肾近曲小管细胞轻度肿胀伴空泡变性，但未见明显坏死征象。鉴于上述实验结果，我们认为，尽管P188是众多表面活性剂中安全性很高的一种，但浓度为15%、剂量为250 mg/kg的P188对大鼠肾脏仍有一定程度的损害。

综上所述，P188可减少缺血再灌注损伤大鼠的心肌梗死面积及心肌细胞凋亡率、降低hs-cTnI水平，减轻心肌损伤；其对心功能无明显改善作用，且对肾近曲小管细胞有一定损伤。P188减轻MIRI的机制与其细胞膜稳定作用有关，但P188不能逆转持续破坏作用下导致的细胞膜破裂。