桑黄提取液抗尿酸活性的研究

刘帅阳，廖宣宇，余戎镇，杨振贇，韩 鏐，郭 琼，施 维*

（吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室·生命科学学院长春·130012）

痛风是一种嘌呤代谢紊乱所致的慢性代谢紊乱疾病。主要临床特点是体内尿酸产生过多或肾脏排泄尿酸减少，引起血中尿酸升高，形成高尿酸血症以及反复发作的痛风性急性关节炎、痛风石沉积、痛风性慢性关节炎和关节畸形等。痛风常累及肾脏而引起慢性间质性肾炎和尿酸性肾结石。原发性痛风除少数由于遗传原因导致体内某些酶缺陷外，大都病因未明，并常伴有肥胖、高脂血症、高血压、冠心病、动脉硬化、糖尿病及甲状腺功能亢进等。继发性痛风是继发于白血、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、溶血性贫血、真性红细胞增多症、恶性肿瘤、慢性肾功能不全、某些先天性代谢紊乱性疾病如糖原累积病I型等。目前临床上治疗痛风的药物常具有一定的毒副作用，长期服用容易诱发肝肾衰竭等疾病。

桑黄又称桑臣、桑耳、胡孙眼、桑黄菇等，因多寄生于桑树上而得名，在我国大部分地区均有分布，是一种珍贵的大型食药两用菌，素有“森林黄金”之称。桑黄在我国的应用已经有相当长的历史，古代药典中对其治疗妇科急症、泻血、血淋疼痛等功效进行了详细记载，在现代，因其突出的调节免疫力、抗肿瘤、抗氧化活性，逐渐成为国内外关注的重点。一系列研究表明，桑黄具有降血糖、抗癌、抗氧化、免疫调节、保肝护肝、及抗肝硬化等药理作用，而对桑黄抗尿酸活性的研究仍然很少。尿酸主要是由黄嘌呤在XO酶的作用下氧化而来，而黄嘌呤由上游次黄嘌呤转化得到，次黄嘌呤可在HGPRT酶的作用下转化为其他物质，所以说尿酸的生成量与XO酶和HGPRT酶的表达及活性密切相关。本文利用液体发酵，研究桑黄提取物对XO和HGPRT基因表达以及酶活的影响，揭示其抗尿酸的相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

胎牛血清，DMEM培养基，胰酶，细胞培养皿，离心管、枪头等耗材，0.22 μm滤膜，测HGPRT酶活用的ELISA试剂盒，预染蛋白Marker，RIPA裂解液，细胞计数板，Tris缓冲液，PBS缓冲液，TransZol Up RNA提取液，Takara试剂盒，长白山桑黄，LO2细胞 （培养于DMEM培养基中）。

HC-3018R高速冷冻离心机，DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，WFH-201BJ紫外可见投射反射仪，紫外分光光度计，基因扩增仪，GF-M3000酶标仪，78-1磁力加热搅拌器，恒温振荡器，超声波细胞粉碎机隔音箱，电子天平，电热恒温培养箱，TGl-16G离心机，全自动玻璃发酵罐，LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器。

1.2 实验方法

1.2.1 桑黄的培养

取生长于长白山地区的桑黄子实体为菌种，通过液体发酵培养（配方为土豆两个、葡萄糖40g、纯净水3L）在5L的发酵罐中发酵5天，发酵参数为温度28℃、转速120 rpm/min、pH 6.5，获得桑黄子实体和培养液的混合物。

1.2.2 桑黄提取物的制备

将桑黄子实体和培养液的混合物进行超声破碎并过滤，将滤液12000 r/min，4℃离心5min获取上清液，标记为A于4℃条件下保存备用。

将桑黄子实体 （破碎成粉末）96℃水浴加热30 min中得到桑黄水提物，过滤并离心得上清液，标记为B于4℃条件下保存备用。

1.2.3 桑黄提取液主要成分检测

将A、B两组样品进行飞行质谱检测，对质谱结果进行比较分析。

1.2.4 冷冻干燥制得母液

通过低温真空冻干方法将A液冻干，得黄褐色粉末即为桑黄提取物干粉，称取0.6 g加入10 ml去离子水制成桑黄母液，浓度为0.06 g/ml。

1.2.5 RNA的提取

将 母 液 分 别 稀 释 成 0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 g/ml的浓度作用于生长状况良好的人体肝脏细胞中，作用48 h后用TransZol Up提取细胞中的RNA。每 10 cm2生长的培养细胞中加入 1 ml的TransZol Up，然后用移液枪吹打细胞使其脱落，将裂解液转移至离心管中，8000 g，4℃离心2min弃上清，向每1×107个细胞中加入1ml的TransZol Up，吹下细胞后静置5 min，加入0.8 ml氯仿剧烈振荡30 s，室温孵育3min。10000 g，4°C离心15min，此时样品分为三层，无色的水相（上层），中间层和有机层，转移无色的水相于新离心管中，每使用1 ml TransZol Up加入0.5 ml的异丙醇，颠倒混匀室温孵育10min。去上清加1 ml 75%乙醇剧烈漩涡，7500 g，4°C 离心 5min。弃上清，沉淀溶于 100 μl RNA Elution Buffer中。

1.2.6 qRT-PCR检测XO酶和HGPRT酶基因表达量的变化

将提取的RNA进行PCR扩增，引物序列如下，XO：Sense 为 5’-GATGGGCCAAGGCCTTCATA-3’，anti-sense 为 5’-CTGACAAGCCGCATAGACGG-3’；HGPRT：Sense为 TGACCAGTCAACAGGGGACAT，anti-sense为TTTCACCAGCAAGCTTGCGA。用Takara公司的实时荧光试剂盒进行荧光定量法检测，具体步骤如下。

在反应管中按照下表1进行配制，42°C反应2 min，去除基因组的DNA。进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。

表1 反应体系1Table 1 reaction system1

按下表2配制反应体系，轻柔混匀后立即进行反转录反应，条件为37°C反应15 min，85°C反应5 s。

表2 反应体系2Table 2 reaction system2

在冰上按下表3配制qRT-PCR反应体系，应用Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR System进行检测，采用两步法PCR扩增标准程序：第一步为95°C反应30 s； 第二步为95°C反应5 s，60°C反应34 s，40 个循环。

表3 反应体系3Table 3 reaction system3

1.2.7 HGPRT活性的检测

将母液分别稀释成 0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 g/ml的浓度作用于生长状况良好的人体肝脏细胞中，48 h后提取细胞中蛋白质，然后利用蛋白质试剂盒进行蛋白质的定量，按照样品中最低浓度进行倍比稀释，通过人HGPRT酶联免疫分析试剂盒测定HGPRT酶的活性，具体步骤如下：先将标准品按示意图分别稀释为20、40、80、160、320 U/L，往 HGPRT 抗体包被的 96 孔板中加入准备好的样品和标准品，37℃反应30min。洗板5次，加入酶标试剂37℃反应30min，洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色10min。加终止液，15min内在495nm处测OD值。

2 实验结果及其讨论

2.1 桑黄提取液的主要成分

查阅文献资料得知桑黄主要活性成分为多糖，根据质谱检测结果分析桑黄提取液中主要多糖活性物质的相对分子质量约为800～850。

2.2 细胞毒性的检测

如图4所示，用药量超过0.20 g/ml后大量贴壁细胞悬浮在液体上层，由不透光的梭形活细胞变为透光的圆形死细胞，细胞出现较多死亡，因此桑黄提取液浓度超过0.20 g/ml后对细胞的毒性较大。

2.3 XO基因及HGPRT基因的表达量的检测

由图5可以看出，在转录水平上XO随着桑黄提取液用药量的增加而逐渐减少，药物浓度为0.005 g/ml时即对XO基因有着较强的抑制，因此药物通过抑制XO基因表达对XO合成有抑制作用，进而黄嘌呤转化为尿酸的反应受到抑制，尿酸合成受阻；HGPRT基因的表达随着桑黄提取液给药量的增加而逐渐增多，药物对HGPRT合成具有促进作用，有利于尿酸前体物质次黄嘌呤通过支路途径转化为次黄嘌呤核苷，抑制了尿酸的生成。

2.4 HGPRT酶活的检测

用ELISA酶联免疫法测定通过BCA定量后，不同给药浓度下的细胞蛋白提取物中HGPRT的酶活性，由图6结果显示在一定范围内（0.005～0.15 g/ml）HGPRT酶活性随着给药浓度的提高而逐渐增大，HGPRT通过支路途径将尿酸前体物质转化为次黄嘌呤核苷，进而使尿酸因为原料不足而合成受阻。

3 结论

在本实验条件下，通过液体发酵得到桑黄菌培养液，进行质谱分析后，确定桑黄培养液主要活性多糖成分的相对分子质量为800～850左右。在细胞毒性实验中，发现用药量超过0.20 g/ml后对细胞影响较大，细胞出现较多的死亡。然后将桑黄提取液作用于肝脏细胞后，发现其能够在一定范围内能促进HGPRT基因的表达及其酶活性，使尿酸前体物质黄嘌呤被更多的转化为其他物质，导致尿酸合成受阻；在一定范围内其能抑制XO基因的表达，从而抑制体内尿酸的生成途径的关键酶，使尿酸的合成受阻。本实验从分子水平上研究了桑黄抗尿酸活性的机理，为桑黄资源的开发利用提供了一定的科学依据，并为天然降尿酸药物的开发和桑黄的临床应用提供了一定的理论机理，但桑黄体内抗尿酸活性的研究有待实验进一步的跟进。

致谢：感谢长白朝鲜族自治县林丰菌业有限公司提供的桑黄菌。