山东红豆杉（Taxus media）生物学特点及其理化性质研究

王 欢，张 莉，李齐光，苗泽方，汪 晟，张小葵*，黄建军*

（山东大学威海校区，海洋学院·山东威海·264209）

红豆杉又名紫杉、赤柏松,红豆杉科红豆杉属，常绿乔木或灌木,属第四世纪冰川后的世界级珍稀濒危资源，1999年被列为中国一级保护植物[1]。20世纪60年代，美国科学家从短叶红豆杉(Taxus brevifolia Nutt.)树皮中提取分离得到一种抗癌活性较强,作用机理特殊的物质，称为紫杉醇；紫杉醇的作用机理是通过影响癌细胞的细胞周期，从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂[2]，进一步阻止癌细胞增殖和迁移。紫杉醇的发现使癌症治疗取得重大进展[3]。但紫杉醇在红豆杉中的含量较低，即使当前公认含量最高的短叶红豆杉,其树皮中的紫杉醇也仅含有0.069%[4],且仅有30年以上树龄的红豆杉才存在开发价值[5]。

现代药理学研究表明，红豆杉除了含有抗肿瘤成分紫杉醇外，还含有其他具有抗炎性反应[6]，抗微生物[7]，抗骨质疏松[8]，降低血糖浓度[9]和抗氧化[10]等多种药理作用的化合物成分。

1 材料与仪器

1.1 原料

山东红豆杉 （山东威海荣成天一红豆杉种植公司提供）。

1.2 试剂

甲醇（分析纯、色谱纯）；三氯甲烷（分析纯）等。

1.3 仪器

电子天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）；粉碎机（浙江荣浩工贸有限公司）；恒温水浴锅（龙口市先科仪器公司）；旋转蒸发仪（郑州科泰实验设备有限公司）；旋涡混合器（上海精科实业有限公司）；显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；超声波清洗器（SK8210LHC,上海科导超声仪器有限公司）；低速离心机（SC3610,科大创新股份有限公司中佳分公司）；岛津三重四级杆液相色谱质谱联用仪（LCMS-8040），包括在线真空脱气机（DGU-20A3R），二元高压泵（LC-20ADXR）、自动进样器（SIL-20AXR）、柱温箱（CTO-20A）、三重四级杆串联质谱仪、工作站 （LabSolutions LCMS Version 5 for LCMS-8040）。

2 国内研究现状

红豆杉属植物全世界有11个种，我国有4种1变种，即东北红豆杉 Taxus cuspidata Sieb．et Zucc．云南红豆杉 Taxus yunnanensis Cheng et L．K．Fu．西藏红豆杉Taxus wallichiana Zucc．中国红豆杉Taxus chinensis(Pilger)Rehd．和南方红豆杉Taxus chinensis(Pilger)Rehd．var．mairei(变种)[11]。

东北红豆杉的植物形态，许建闻等的研究表明，东北红豆杉，多为灌木或乔木，树高达20 m，直径达1 m。树冠倒卵形或阔卵形。树皮红褐色。叶生于主枝上部[12]，为螺旋状排列，在侧枝上叶柄基部扭转向左右，排成不规则两列。叶线形，半直或稍弯曲，长1.5～2.5 cm，宽2.5 mm，表面深绿色，有光泽[13]，种子坚果状，具 3～4 条棱脊，假种皮杯状，肉质红色，9～10月果熟[14]。根表面浅红褐色茎。枝表面密布叶柄残基及小枝疤痕。茎栓皮常脱落,露出粉红色内侧木栓层,或黄白色韧皮部,断面木质部年轮密集[15]。

云南红豆杉的植物形态，王磊等的研究表明，云南红豆杉为常绿乔木。叶片螺旋状排列,基部扭转呈假二列羽状展开。质地薄，条状披针形,常呈镰状,边缘向下外卷，尖端渐尖，长 1.5～4.7cm,宽2～3cm，叶面深绿色，中脉两侧各有一条浅黄色气孔带，中脉与气孔带上密生均匀微小角质的乳头状突起[16]。种子生于肉质杯状的假种皮中，成熟后假种皮色泽鲜红[17]。

西藏红豆杉的植物形态，周进等的研究表明，西藏红豆杉为灌木或乔木，树皮灰色或红褐色，树干直径约为1m；叶片小枝排列较密，成彼此重叠的不规则排列。叶线形，先端锐尖边缘后卷，背面中脉处有大量圆形的微小突起。种子长椭圆形，长6.5～7 mm,直径4.5～5 mm[18]。

中国红豆杉的植物形态，费永俊等研究表明，中国红豆杉为大灌木或乔木,树高6～15m，最高可达30m，树冠呈卵状间或塔形，树皮灰色或红褐色，裂成薄片脱落，树干直径约1m。叶片呈假两行排列，线性略呈镰状弯曲。长2～3cm，宽2.5～3mm腹面深绿背面黄绿，两条褐黄色气孔线上有微小突起。种子扁卵圆形，长5～7mm,直径为 4～5mm[19]。

南方红豆杉的植物形态，谢志惠等研究表明，南方红豆杉为常绿乔木树种，叶螺旋状着生，基部扭转呈二列状，线形，微弯而近镰刀状，长 2～3.5cm，宽 3～4cm，先端渐尖，边缘不卷曲，两面中脉隆起；下面中脉两侧各有1条灰绿色或黄色的气孔带[20~21]。其中，1～4年生的南方红豆杉，小枝直径1～2mm，表面黄绿色或黄褐色，断面黄白色，气微，味甘，质硬，不易折断[22]。南方红豆杉的组织显微观察，王晓丽等的研究表明，木栓层2～6层细胞，切向延长紧密；木栓形成层和皮层不明显；韧皮部10～25层细胞，每隔2～6行细胞有1横排韧皮纤维,镶嵌砂晶，每隔3～6列细胞有1韧皮射线，薄壁细胞和射线细胞含有淀粉粒、棕红色内含物及砂晶；筛胞狭长、尖斜[23～24]。

3 山东红豆杉生物学特点

鉴于现有研究的研究对象集中于东北红豆杉、南方红豆杉等，而对于山东红豆杉的分布及研究较少。据资料和调查显示，山东境内的红豆杉种植初成规模，因此选取山东地区种植的红豆杉进行观察研究，旨在研究山东红豆杉的形态特征、表层结构、紫杉醇含量等。

山东红豆杉为曼地亚杂交种，灌木，可用种子繁殖，但出芽较慢，时间较长；现多用扦插繁殖，但季节性强，生根率低，繁殖速度慢。山东荣成种植的红豆杉使用高效配套技术进行繁殖，生根率可达95%左右，25天左右开始生根，根系发达，2个月后即可出圃。对环境适应能力强，侧枝分生能力强，可以长期进行采集枝叶，提炼紫杉醇。据统计，威海市现有种植红豆杉园区主要为山东红豆杉，比较集中的面积约3550亩，小的农户零星种植的山东红豆杉面积总计1000余亩，总计约4550亩，规模如图1、图2所示。

山东红豆杉在多种气候条件下生长良好，可在光照条件差或无光照的条件下较好生长[25]。最适宜种植在排水性良好的砂质微酸性(pH值5.8～6.5)土壤中，年平均气温在2～7℃，年平均降水量为750～1000mm。可耐-30℃以下的低温，抗寒性能力强。天然红豆杉树的紫杉醇一般分布于树皮中，整株利用率低[26]。曼地亚红豆杉植株各部分均含有紫杉醇，枝叶含量达0.03%以上，根系部分可达0.06%[27],全株可用于提取紫杉醇，植株利用率高。山东红豆杉作为杂交种，其深度加工后综合经济价值更高。

3.1 山东红豆杉的植物形态

山东红豆杉为常绿灌木。树皮灰褐色。花单性，雌雄异株。雄球花单生于叶腋，雌球花的胚珠单生于花轴上部侧生短轴的顶端，基部有圆盘状珠托。雄性花蕾比较大比较明显，3月左右开花，给雌株授粉。雌株花蕾比较小。种子扁卵圆形，有2棱，种卵圆形，假种皮杯状，红色。主根不明显,侧根发达 。枝叶茂盛，萌发力强，耐修剪，生长速度快，对环境适应能力强，抗病能力强。适宜生活在气候温和，空气湿度大的地区。叶长条形，多碎断，黄绿色至暗绿色，完整者长15～35mm，宽2～4mm。叶全缘，叶先端渐尖。上面中脉隆起；下面色稍浅，中脉突起。质脆，易折断。气微，味苦而涩。茎呈细长圆柱形，表面黄绿色或棕色，断面中空，详见图3。

3.2 显微观察

将山东红豆杉叶洗净后，切片，进行显微观察：从叶的横切面可以看到，单层表皮细胞排列紧密，外被角质层，表皮由呈扁平状单细胞构成，紧密有序排列；叶绿体含量较多，叶绿素丰富；下部的栅栏组织，由多列紧密排列的栅栏组织细胞构成；海绵组织多为椭圆形细胞构成。中脉易见微小突起，韧皮部外部维管束和木质部薄壁细胞周围略有棕色块，详见图4。

将山东红豆杉茎切片做成装片，进行显微观察：从茎的横切面可以观察到表皮由排列整齐的1列细胞构成；皮层是由不规则的3～5层薄壁细胞构成，排列松散；紧挨着的韧皮部细胞排列松散，呈扁平状；木质部是有3～5层，导管呈辐射状排列，木射线约为1列细胞，髓部较大。内含物位于栓内层与形成层之间的髓鞘，形状不规则，详见图5。

4 理化性质

4.1 山东红豆杉中紫杉醇的提取

山东红豆杉叶片干燥后粉碎，进行紫杉醇的粗提。粗提阶段主要目的在于选择合适的提取溶液。在本实验中，采用甲醇提取红豆杉叶片中的紫杉醇物质[28]。

4.1.1 将红豆杉枝叶放入烘干粉碎，取3g叶片粉末。

4.1.2 将粉末倒入圆底烧瓶内，加入60ml甲醇，置于70℃恒温水浴锅中冷凝回流2h，收集溶液。

4.1.3 继续加入30ml甲醇置于70℃恒温水浴锅中冷凝回流1h。收集溶液。

4.1.4 重复操作（3）1 次。

4.1.5 将收集到的所有溶液于30℃旋转蒸发仪中浓缩至60ml。

4.1.6.加等体积的正己烷，弃上层液，萃取4次。

4.1.7 将得到的溶液于30℃旋转蒸发仪中浓缩至15ml。

4.1.8 用0.45μm滤膜对甲醇提取液进行过滤，即得到供试品粗提液。

4.2 薄层色谱TLC

薄层色谱（Thin Layer Chromatography）是分离红豆杉紫杉醇的常用方法。通过提取液的浓缩，然后在硅胶板上进行点样，在紫外灯下进行紫杉醇的定位。样品位置与标准样进行对照。薄层色谱操作方便，设备简单，分离速度快，灵敏度较高，样品用量少[29]，已广泛应用于天然化合物的分离与鉴定。薄层色谱主要以硅胶为固定相的层析，依据组分之间的极性差异[30]。当组分与固定相亲和力强时，组分与原点位置较近；反之，样品在薄层板上移动距离远[31]。薄层层析的技术关键是固定相的选择和展开剂极性的设定。确定待测组分的比移值（Rf）[32]。在本实验中，以硅胶为固定相，对山东红豆杉进行薄层色谱试验。

4.2.1 取紫杉醇标准品1.8mg，溶于800μL甲醇溶液，配置成紫杉醇标准品2mg/ml。

4.2.2 按照三氯甲烷：甲醇=12：1的比例配置展开剂，用毛细管分别吸取样品液和标准液，在硅胶板上进行点样，放入层析杠中进行展开。

4.2.3 待展开剂跑到硅胶板的3/4时，取出硅胶板，标记好溶剂前沿，置于254nm三用紫外灯下进行观察，比较标准品和样品位置，计算 Rf值[33～34]。

4.3 HPLC-MS

高效液相色谱 （High Performance Liquid Chromatography,HPLC）是一种药物鉴别技术。以液体为主要流动相，通过高压输液系统，将隔离缓冲液和混合溶剂泵入色谱柱[35]。在流动相和色谱柱确定的条件下，每种物质或药品具有其独特的保留时间[36]。

液相色谱-质谱联用是高效液相色谱与质谱的联合，兼具液相色谱法与质谱分析的优点，即样品的净化和确证分析；前者可以除去样品的杂质，后者可以通过离子碎片的质荷比信息确认紫杉醇的含量[37]。

色谱条件：EclipsePlus C18色谱柱（2.1×50 mm i.d.，1.8μm)；流动相：5mmol/L 乙酸铵含 0.02%甲酸（A）-乙腈 （B）； 线性梯度洗脱程序：0～15min， 流速：0.2m L/min；进样量：10μL。

质谱条件：ESI电离源；正离子扫描；雾化器流量：3L/min。干燥器流量：15.0L/min。DL温度：250℃。加热块温度：400℃。检测器电压：1.94k。

对照品储备液的制备：称取紫杉醇对照品1.3mg，用70%乙腈溶解，制得浓度1 mg·m L-1标准品溶液。

样品溶液的制备：山东红豆杉甲醇粗提物于旋转蒸发仪中蒸干，用70%乙腈溶液进行溶解。

5 结果

5.1 薄层色谱

观察到在紫杉醇标准品同一位置有相同的斑点，详见图6，Rf值为0.60。表明山东红豆杉叶片中含有紫杉醇。

5.2 标准曲线的制备

取紫杉醇对照品分别配置成0.050、0.125、0.250、0.500、1mg·m L-1。 各进样 10μl，以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标，紫杉醇标准曲线回归方程：Y=1.27901E+006*X+611904（r=0.984）。

5.3 液相色谱-质谱联用测试结果

在前述液质条件下进样，全离子扫描一级质谱时，已知紫杉醇分子量为854，所以设置分子量范围m/z 50-900；碰撞电压20-22V，MRM扫描Q1。得的紫杉醇标准品前体离子LC-MS图谱，详见图7。

选择前体离子扫描时，设定m/z=854，采用数据依赖模式（DDA）进行二级质谱扫描，裂解能为23%。得到紫杉醇标准品产物离子的LC-MS图谱，详见图8。

在上述实验条件下分别进样山东红豆杉的树皮，茎和树叶，测得树皮的紫杉醇浓度为38.838mg/kg；茎的紫杉醇浓度为0.482mg/kg；叶的紫杉醇浓度为5.082mg/kg。

6 讨论与展望

南方红豆杉叶片较东北红豆杉和山东红豆杉宽且长。山东红豆杉较东北红豆杉较长。南方红豆杉中脉向上突出，薄壁细胞中含草酸钙砂晶及红棕色物。山东红豆杉中脉微向下突出，薄壁细胞中红棕色物及草酸钙砂晶较少。为山东红豆杉的鉴定提供一定的资料依据。

山东红豆杉中除含有紫杉醇外，还富含7-木糖基紫杉烷类化合物，及三尖杉碱类等化合物，这些成分也存在着多种不同的药理作用，后续实验可结合提取方法以及色谱条件将其它成分进行提取验证。

红豆杉作为抗癌药物被大力开发，而紫杉醇在红豆杉中的含量较低，而癌症患者数目巨大，目前每年紫杉醇的消耗量为1500～2500千克[38]，对山东红豆杉的鉴定研究有利于其规范成药，拓宽紫杉醇的提取原料范围，有利于野生资源保护。山东红豆杉作为一个新杂交种，其根系发达，适应性强，为常绿灌木，含有丰富的紫杉醇。同时，山东红豆杉存在极高的开发价值。作为一个绿色、环保、健康的种植物，是高档的常绿观赏植物[39]。我国丘陵多平原少,绿化面积较小。可以利用山东红豆杉的生物学特性，以及在不同地区的自然资源和区位优势，发展山东红豆杉经济林生产，不仅可以绿化荒山，保持水土，具有良好的生态环境效益，而且还可以通过提取红豆杉中的紫杉醇，拉动地方的经济发展，从而产生经济效益。人工种植山东红豆杉，既有生态效益、社会效益，又具有经济效益，是一个前景广阔的种植产业。