复方双参颗粒中人参皂苷含量测定

姜丽萍,侯会芳，王振波，李桂荣,尚金燕，姜志辉*，黄建军*

（1.天参密码药业股份有限公司，威海264211；2.山东药品食品职业学院，威海264210；3.山东大学（威海）海洋学院，威海264209）

人参来源于五加科人参属植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根，主产于我国东北，尤以吉林省产量最大，质量最佳，是我国传统的珍贵药材。人参大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智。根据加工方法不同，分为鲜人参、生晒参、红参等产品。人参是百草之王，红参是人参的熟用品，具有大补元气，复脉固脱，益气摄血功效。红参的加工方法是用人参经过浸润、清洗、分选、蒸制、烘干等工序加工而成。红参在蒸制过程中，因为热处理会发生化学反应，成份上发生变化，生成红参特有的生理活性物质，例如人参皂苷-Rg3、Rh2等抗癌活性成分，具有抑制癌细胞增长的作用。在补虚方面红参强于白参，久服红参可以补气、益血、生津、强心、补脾健胃、益肺、提高人体免疫力、抗氧化、抗疲劳、抗衰老、抗辐射、抑制肿瘤、调整人体内分泌系统。在癌症手术后,红参还能够减轻放化疗后产生的许多毒副作用。

海参属于海参纲（Holothuroidea），是生活在海边至8000米的海洋棘皮动物，距今已有6亿多年的历史，海参以海底藻类和浮游生物为食。海参全身长满肉刺，广布于世界各海洋中。中国南海沿岸种类较多，约有二十余种海参可供食用。海参同人参、燕窝、鱼翅齐名，是世界八大珍品之一。海参不仅是珍贵的食品，也是名贵的药材。据《本草纲目拾遗》中记载：海参，味甘咸，补肾，益精髓，摄小便，壮阳疗痿，其性温补，足敌人参，故名海参。海参具有提高记忆力、延缓性腺衰老，防止动脉硬化以及抗肿瘤等作用。

将人参、海参等以营养学和中医药学为基础，通过现代科学技术研发具有改善记忆、预防老年痴呆、抗衰老等营养保健作用的双参颗粒功能食品。由于人参皂苷是人参的标志性成分，也是主要活性成分，所以双参颗粒以人参皂苷含量作为其质量标准之一。

目前有许多检测人参皂苷的方法。本文采用药典方法、国家农业行业标准NY/T1842-2010，《保健食品检验与评价技术规范手册》2003版检验方法和红参分等质量GB/T 22538-2018检验方法测定样品中人参皂苷-Rg1、人参皂苷-Re、人参皂苷-Rb1和总皂苷含量，以比较4种检验方法测定人参皂苷含量的高低，为食品、保健食品和药品企业含有人参的产品制定企业标准提供参考数据[1～13]。

1 实验材料、仪器与试剂

1.1 实验材料

天参密码高丽红参（将进口韩国高丽鲜人参，采用韩国红参加工工艺和中国红参加工技术相结合制备而成），配伍威海产海参、昆布、核桃、黑豆、黑芝麻、燕麦、胡萝卜、无花果、大枣、适量麦芽糊精通过现代科学技术研发制备为双参颗粒。

1.2 仪器

UltiMate3000高效液相色谱仪，包括：四元泵，在线脱气机，柱温箱，UV检测器，化学工作站（Chromeleon TM变色龙工作站）；UV-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；索氏提取器。

1.3 试剂

乙腈（美国Fisher公司，色谱纯），其他试剂为分析纯。人参皂苷对照品人参皂苷-Rg1，批号：110703-201529，纯度：95.0%、人参皂苷-Re，批号：110754-201525，纯度：92.3%、人参皂苷-Rb1，批号：110704-201424纯度为93.7% (购于中国食品药品检定研究院)、D-101大孔吸附树脂；3cmAmberlite-XAD-2大孔树脂、中性氧化铝，乙醇、甲醇、正丁醇、香草醛-冰乙酸溶液、高氯酸、冰乙酸、硫酸、乙醚（均为分析纯）。

2 方法

2.1 药典方法

2.1.1 人参皂苷-Rg1、人参皂苷-Re、人参皂苷-Rb1的含量测定（按照高效液相色谱法测定）

2.1.1.1 色谱条件与系统适用性实验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的 规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。

时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%）0～35 19 81 35～55 19→29 81→71 55～70 29 71 70～100 29→40 71→60

2.1.1.2 对照品溶液的制备

分别取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成每1mL中含人参皂苷Rg1 0.5mg、人参皂苷Re 0.3mg、人参皂苷Rb1 0.5mg的混合溶液，即得。

2.1.1.3 供试品溶液的制备

取本品粉末约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷适量，加热回流3h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50mL，密塞，放置过夜，超声处理 （功率250W，频率50kHz）30min，滤过。精密量取续滤液25mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.1.4 方法学考察

a.线性关系的考察

吸取上述对照品溶液，分别进样 2、4、8、10、12μL，按上述色谱条件进行HPLC分析，以峰面积和进样质量进行线性回归，人参皂苷Rb1线性方程为Y=603105 X+74303.3（R=0.9989，n=5），人参皂苷 Rg1 线性方程为 Y=681792 X+47625.1（R=0.9991，n=5），人参皂苷Re线性方程为Y=821967X+27568.0（R=0.9993，n=5），结果表明人参皂苷Rb1在2～12μg与峰面积具有良好的线性关系，人参皂苷Rg1在2～12μg与峰面积具有良好的线性关系，人参皂苷Re在2～12μg与峰面积具有良好的线性关系。

b.精密度实验的考察

精密吸取人参皂苷 Rb1、Rg1、Re对照品溶液(1.0mg/mL)10μL,重复进样5次,测定人参皂苷Rb1、Rg1、Re峰面积,得其 RSD分别为 1.06%、1.14%、1.25%。实验结果表明，实验设备具有良好的精密度

c.稳定性实验的考察

取双参颗粒样品，按上述制备方法制备供试品溶液，进样10μL,每隔2h测定1次，样品中人参皂苷Rb1、Rg1、Re峰面积的 RSD 分别为 1.48%、1.67%、1.13%(n=5)。实验结果表明,样品在8h内稳定。

d.重现性实验

取双参颗粒样品,按上述制备方法，重复制备5份供试品溶液，分别测定,结果中人参皂苷Rb1、Rg1、Re质量分数的RSD分别为1.85%、1.48%、1.42%。实验结果表明，该实验方法重现性良好。

e.回收率实验

采取加样回收法。精密称取5份双参颗粒样品2.000g,分别加入一定量的人参皂苷Rb1、Rg1、Re对照品，制备供试品溶液，进行测定，计算得人参皂苷Rb1、Rg1、Re平均回收率分别为 100.17%、99.06%和98.65%，RSD分别为1.53%、1.81%和1.36%(n=5),表明结果准确可靠。

2.1.1.5 样品测定 取3批双参颗粒样品，按上述方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液10μL与供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，在上述选定的色谱条件下进行分析，将其峰面积代入相应的回归方程，并计算 Rb1、Rg1、Re的含量。

2.2 中华人民共和国农业行业标准（NY/T 1842-2010）方法

2.2.1 人参皂苷-Rg1、人参皂苷-Re、人参皂苷-Rb1的含量测定

2.2.1.1 对照品溶液的制备

准确称取 Rg10.163 g、Re 0.183 g、Rb10.255 g(精确至0.0001 g)人参皂苷对照品,置于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成质量浓度为 1.6、1.8、2.5 g/L的混合标准溶液,贮存在-18℃以下冰箱中,有效期6个月。

2.2.1.2 供试品溶液的制备

准确称取样品2 g(精确至 0.001 g),加入100 mL乙醚于索氏提取器中,提取1 h，弃去乙醚,待残渣中乙醚挥干后,再加入甲醇回馏8 h。回流后提取液在60°C水浴条件下，经旋转蒸发仪减压浓缩至近干,氮气吹干,加入4 mL去离子水充分摇匀。

2.2.1.3 SPE C18柱的预处理

先用20 mL去离子水淋洗，然后用20 mL的甲醇对SPE C18柱进行活化，再用20 mL去离子水平衡。待水与柱筛板近平时上样。取2 mL注入预先活化好的SPE C18柱中，待液面与柱筛板近平时，倒人10 mL去离子水淋洗SPE C18柱，弃去流出液，待淋洗液液面与柱筛板近平时，加入25 mL乙醇溶液(70%)洗脱SPE C18柱，收集洗脱液于50 mL刻度试管中，氮气吹至25 mL以下，用甲醇定容至25 mL，混匀后，用 0.2 μm滤膜过滤，待测。

2.2.1.4 测定

a.仪器参考条件

色谱柱：C18(4.6mm X 300mm X 0.5 μm)，流动相：甲醇十水，柱温：47℃，流速：0.8 mL/min检测波长：202nm，进样量：10μL，梯度洗脱程序见表 1。

表1 梯度洗脱程序

b.标准曲线的绘制

用混合单体人参皂苷标准工作液按着梯度洗脱程序进行分析。 准确吸取 0、2、4、6、8、10 mL 混合单体人参皂苷标准溶液,分别置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,准确吸取10μL各容量瓶中的标准溶液,分别注入液相色谱仪,记录峰面积。以各人参皂苷进样的质量浓度对其峰面积绘制标准曲线。

c.样品测定

准确吸取10μL供试样品溶液注人液相色谱仪,以保留时间定性,以待测液峰面积与标准溶液峰面积比较定量。

d.空白实验

不加试样,采用与试样完全相同的测定步骤进行平行操作。

2.2.1.4 结果计算 试样中人参皂苷的含量用质量分数ω表示,单位为(%),按下列公式计算：

式中：

m1一试样中某种人参皂苷的含量,单位为毫克(mg);

m2-一试样称样的质量,单位为克(g);

V1-一试样的进样体积,单位为毫升(mL);

V2一试样的定容体积,单位为毫升(mL)。

2.3 《保健食品检验与评价技术规范手册》2003版方法

2.3.1 人参皂苷-Rg1、人参皂苷-Re、人参皂苷-Rb1的含量测定

2.3.1.1 液相条件

色谱柱：反相 C18柱，4.6×250mm，5μm； 紫外检测器：检测波长203；柱温：35℃。梯度洗脱条件，详见表2。

表2 梯度洗脱条件

2.3.1.2 样品制备

将样品研成粉末，过20目筛，精确称取该粉末适量于50mL容量瓶中，加水50mL于超声波清洗器中提取30min，取出，待溶液恢复常温后，定容至50mL。再准确量取10mL，通过D-101大孔吸附树脂净化柱（大孔吸附树脂使用前先用甲醇浸泡，水洗，装成10cm长小柱），小柱先用10mL水冲洗，弃去水液之后，用70%甲醇50mL洗脱皂苷，收集甲醇溶液，水浴上蒸干，残渣以甲醇溶解并定容至5mL，该样液离心后过0.2μm的滤膜，滤液进行色谱分析。

2.3.1.3 试样测定

a.标准曲线的制备

将混合标准系列溶液均取10μL进液相分析，用峰面积对浓度作各人参皂苷的标准回归曲线。b.试样的测定

取10μL试样净化液进高效液相色谱仪，以绝对保留时间定性，用峰面积通过各人参皂苷标准曲线定量计算试样中人参皂苷-Rg1、人参皂苷-Re、人参皂苷-Rb1的含量。

2.3.1.4 计算：

C—试样溶液中各人参皂苷的含量，mg/mL

M—试样的称样量，g。

2.3.1.5 方法学考察

a.线性关系

精密称取以60℃减压干燥10h的人参皂苷-Rg1 10mg，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容。使对照品溶液（母液）的浓度约为1mg/mL。然后分别吸取50μL、100μL、200μL、400μL、800μL、1.6mL、3.2mL 对照品溶液（母液）分别置于各个10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制备成不同浓度的对照品溶液，分别精密吸取不同浓度的对照品溶液各20μL进样。以色谱峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，经统计学计算得直线回归方程，回归方程为：Y=33.5042+501.2928X，r=0.9997

b.稳定性实验

取人参皂苷-Rg1的对照品溶液，精密吸取20μL，按上述色谱条件，分别于0、2、4、8h检测，峰面积RSD为1.98%。

c.精密度实验

取人参皂苷-Rg1的对照品溶液，精密吸取20μL，按上述色谱条件进样分析，连续5次，测定峰面积，其RSD为1.92%。

d.重现性实验

取同一粉碎后的红参样品5份，分别处理后，分别精密吸取20μL按上述色谱条件测定，峰面积RSD为2.66%。

e.回收率实验

采用加样回收法，取已知含量的红参粉末2g，精密称定，分别准确加入一定量的人参皂苷对照品，按上述色谱条件测定，平均回收率为99.85%，RSD为3.28%。

2.3.2 人参总皂苷含量测定

2.3.2.1 人参总皂苷的含量测定

a.样品制备

将样品研成粉末，精确称取该粉末适量于100mL容量瓶中，加水60mL于超声波清洗器中提取30min，取出，待溶液恢复常温后，定容至100mL，准确量取1mL，进行柱层析。

b.柱层析

用10mL注射器作层析管，内装3cmAmberlite-XAD-2大孔树脂，上加1cm中性氧化铝。先用25mL70%乙醇洗柱，弃去洗脱液，再用25mL水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0mL已处理好的试样溶液。用25mL水洗柱，弃去洗脱液，用25mL70%乙醇洗脱人参皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60度水浴挥干，显色用。

c.显色

在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL5%香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣都溶解，再加0.8mL高氯酸，混匀后转入5mL带塞刻度离心管中，60度水浴上加热10min，取出，冰浴冷却后，准确加入冰乙酸5.0mL，摇匀后，以1cm比色池于560nm波长处与标准管一起进行比色测定。

d.标准管

吸取人参皂苷Re标准溶液 （2.0mg/mL）100μL放蒸发皿中，置水浴挥干（低于60℃）或热风吹干 ，再同样品“柱层析 ”操作。

e.计算

X-试样中总皂苷量（以人参皂苷Re计），g/100g

A1—样品吸光度值

A2—标准液吸光度值

C—标准管人参皂苷Re的量，μg

V—试样的稀释体积，mL

m-样品的称样量，g

2.4 人参总皂苷含量测定（红参分等质量GB/T 22538-2018）方法

2.4.1 原理

样品用乙醚脱脂后，用甲醇回流提取后再用水饱和的正丁醇超声萃取纯化皂苷，人参皂苷可以与硫酸-香草醛显色，在544nm波长处有最大吸收峰，在一定浓度下符合朗伯-比尔定律。

2.4.2 分析步骤

2.4.2.1 供试品溶液的制备

取供试品约1g，精密称定，用中性滤纸包好，置于索氏提取器中，加入乙醚，微沸回流提取1h，弃去乙醚液，供试品药包挥干乙醚溶剂，再置于另一索氏提取器中加入甲醇浸泡过夜，次日再加入适量甲醇开始微沸回流提取，回流6次，以人参皂苷提尽为准（定性鉴别阴性）。合并甲醇提取液，回收甲醇，少量提取液置于蒸发皿中，水浴蒸干。用蒸馏水溶解提取物，加水30～40ml至分液漏斗中用水饱和正丁醇30ml进行萃取，共4次。取上层液蒸干，加甲醇溶解后，转移至10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

人参皂苷提取定性鉴别：供试品回流提取6次以后，取少量点于硅胶G薄层板（105℃活化10min）上，用10%硫酸乙醇溶液显色，即将薄层板置于通风橱内，喷10%硫酸乙醇溶液，105℃加热10min，总皂苷阳性应为紫红色斑点。也可将薄层板置于碘气缸中数秒钟即取出，以没有紫黄色斑点为阴性。判断人参皂苷是否提取完全，应以索氏提取器中载供试品瓶中的溶液定性鉴别为阴性为准。

2.4.2.2 对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Re对照品10mg，置于10ml量瓶中，加甲醇适量使其溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.2.3 标准曲线的制作

精密 吸取 人 参 皂 苷 Re 对照 品 10、20、30、40、60μL，置于磨口带塞试管中，水浴蒸干甲醇后，加入8%香草醛乙醇试液0.5ml、72%硫酸溶液5ml，充分振摇混匀后置于60℃恒温水浴上加热10min，立即用冰水冷却10min，摇匀。以试剂作空白，按照分光光度法于544nm波长处分别测定吸光度，绘制浓度吸收曲线，做回归方程：［CONC］=a×abs+b

2.4.3 测定

精密吸取供试品溶液20μL，置于具塞刻度试管中，水浴蒸干甲醇后，加入8%香草醛乙醇试液0.5ml、72%硫酸溶液5ml，充分振摇混匀后置于60℃恒温水浴上加热10min，立即用冰水冷却10min，摇匀。以试剂作空白，按照分光光度法于544nm波长处分别测定吸光度。

2.4.4 分析结果计算

以质量分数（%）表示红参中人参总皂苷含量（X）按下式计算

式中：

［CONC］—曲线上读出样品含量，单位ug；

V1——定容体积，单位为毫升（ml）

V2——取样体积，单位为微升（μl）

m——供试品称样量，单位为毫克（mg）

3 结果

详见表3。

表3 不同方法测定双参颗粒中人参皂苷含量的对比（mg/g）

备注：

1药典方法（公司化验室检测）

2农业行业标准（公司化验室检测，未过SPE C18柱）

3农业行业标准（公司化验室检测，过SPE C18柱）

4保健食品方法（公司化验室检测）

5 GB/T 22538-2018单体皂苷检测方法与药典方法相同（公司化验室检测）

6 Rg1-人参皂苷，Re-人参皂苷，Rb1-人参皂苷

4 讨论

以含有人参的双参颗粒产品制定标准需要以单体人参皂苷-Rg1，人参皂苷-Re，人参皂苷-Rb1含量作为检测指标。由于双参颗粒含有大量的蛋白质、脂肪等干扰成分，采用常规方法难以将红参中的有效成分提取分离，因此本实验研究了多种供试品溶液的制备方法。我们通过实验数据认为：药典方法最佳，能够将人参皂苷从样品中提取分离出来，检测结果稳定，重现性好，能够有效控制产品质量。也可选用中华人民共和国农业行业标准（NY/T1842-2010），该两种方法均有利于企业产品质量标准达标。农业行业标准中的方法检测结果与药典方法差别不大，但样品的前处理相比药典较为复杂，且操作中的过SPE C18柱过程繁琐耗时长，对柱的性能要求较高，才能保证较高的稳定的回收率，使结果的重现性达到要求，不如药典法重现性好且易于操作。保健食品方法检测单体皂苷由于用水做溶剂，对以人（红）参或人（红）参提取物为主要原料的保健食品，如红参茶、红参冲剂中的人参皂苷提取效果很好。