低强度激光对运动性免疫抑制大鼠的干预效果研究

覃 飞，赵杰修，王松涛，郝选明*

流行病学调查和实验研究表明，急性极限运动、无运动习惯的机体参与强度过大的运动，以及长期大强度训练均能导致不同程度的运动性免疫抑制（exercise-induced immunosuppression，EIS）（Gleeson et al.，2013；Walsh et al.，2011）。已有研究发现，长期大强度训练导致的EIS是整体性的，其影响可涉及免疫细胞的数量（Sugama et al.，2015；Walsh et al.，2011）、淋巴细胞亚群的比例（王茹 等，2009；Saito et al.，2003）、淋巴细胞增殖与分化能力（李玉周 等，2010）、抗体的分泌（Colbey et al.，2018）、细胞因子的合成与释放（Kakanis et al.，2014）、免疫器官的结构与功能（丁响 等，2016；张馨蕾 等，2015）等多方面，即过度训练可造成免疫细胞、免疫组织、免疫器官和调节因子等多个层面的损伤或失衡。同时，过度训练对机体免疫机能的影响也是一个渐进性的动态过程（Gleeson et al.，2013；Walsh et al.，2011）。因此，无论是评价运动对机体免疫机能的影响，还是研究EIS的各种调理手段，都应该从整体性和动态性出发。

既往研究和实践中已应用营养、中药和针灸理疗等多种手段调理EIS。但多方面的原因而制约了它们在实践中的应用（如安全剂量问题、效果不确定、兴奋剂风险、技术要求较高等）。20世纪60年代初，激光生物学的研究开始兴起。到目前，低强度激光不仅在炎症、常见慢性病、肿瘤等多种疾病的临床治疗中得以应用，而且在运动医学领域也开展了系列研究和实践探索，尤其是在运动损伤的治疗与康复方面（Vanin et al.，2018）。但低强度激光在EIS调理中的应用尚处于起步阶段，缺乏充足的实验证据。同时激光属于物理干预手段，对运动员不存在兴奋剂的风险，可作为职业运动员和运动爱好者机能强化和相关疾病治疗的一种潜力手段。因此，需要更多的实验研究证明和完善。

本研究以6周递增负荷训练大鼠为动物模型，以不同照射剂量的低强度激光为干预手段，通过检测反映机体整体免疫机能的指标（白细胞分类计数、细胞因子含量、抗体和补体浓度、淋巴细胞增殖能力、免疫器官形态结构等）的动态变化（第0、2、4、6周），观察和评价运动和激光对机体免疫机能的影响，并比较不同剂量组激光照射的干预效果，探讨EIS的发生发展过程以及低强度激光的调理方法和效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级Sprague-Dawley大鼠（雄性，8周龄，体重238±34 g）104只，购自广州中医药大学实验动物中心。标准饲料和环境饲养，自然昼夜节律。随机分为安静对照组［control（C），32只］、运动训练组［exercise （E），24只］、运动和小剂量激光干预组［exercise + low level laser （E+LL），24只］、运动和大剂量激光干预组［exercise + high level laser （E+HL），24只］。各运动组进行6周递增负荷跑台训练。训练计划开始前24 h随机选取C组大鼠8只，取材测试，作为各组大鼠正式训练前（Week0）的基础对照值。训练开始后分别于2nd、4th、6th周的末次运动后48 h，运动各组随机选取8只大鼠处死取材测试，将取材时间点分别记为Week2、Week4和Week6。

1.2 干预手段

1.2.1 运动方案

6周递增负荷跑台训练方法（覃飞 等，2012；张琳 等，2012）：跑台，坡度0°，递增跑速（第1周为10 m/min，第2周为20 m/min，从第3周开始，跑台速度每周递增5 m/min，直至第6周达到40 m/min）。运动强度参照文献（Høydal et al.，2007），并利用Oxymax大鼠代谢监测系统（Columbus，USA）进行确定。每次运动30 min，每天1次，每周6次，周日休息，共持续6周。

1.2.2 低强度激光照射方案

采取鼻腔外照射（刘承宜 等，2009）氦氖激光（632.8 nm），光斑面积0.018 cm2。运动训练结束后2 h对大鼠进行不同剂量的低强度激光照射。单手固定大鼠，光纤探头照射鼻甲两侧，每次2 min，每日1次，每周6次，共6周。根据前期预实验的结果确定本研究的照射剂量，小剂量组（E+LL）辐射功率1 mw，能量密度6.8 J/cm2，功率密度0.06 mw/cm2；大剂量组（E+HL）辐射功率2 mw，能量密度13.6 J/cm2，功率密度0.12 mw/cm2。单纯运动组（E）和安静对照组（C）进行模拟激光照射（操作时激光光源处于关闭状态）。

1.3 检测指标

1.3.1 取材

分别于训练计划开始前24 h（0周），训练开始后第2、4、6周的末次运动结束后48 h，各运动组大鼠随机选取8只，处死并取材。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，75%乙醇全身消毒，超净工作台内取材。腹主动脉取血部分用于血细胞计数测试，其余制备血清（4 000 r/min，离心20 min），分装后置于-80℃冰箱保存待测。摘取脾脏，称重，剪取3/4放入装有已灭菌PBS的EP管中，用于淋巴细胞增殖试验，剩余1/4置于固定液中固定。摘取大鼠胸腺（称重）和股骨，剔除周围结缔组织，置于10%中性甲醛中固定。

1.3.2 血液学指标

利用日本光电Mek-7222k全自动血球计数仪及相关大鼠血细胞检测分析软件进行白细胞五分类测试。利用全自动生化分析仪检测血清中免疫球蛋白IgM、IgG及补体C3、C4含量。使用夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中CRP、IL-10、TNF-α含量。

1.3.3 T淋巴细胞增殖试验

无菌摘取脾脏后放入PBS溶液中，置于200目筛网上轻轻研磨，利用淋巴细胞分层液提取淋巴细胞。低温离心，洗涤细胞2次，悬浮于PBS中，400目尼龙网过滤。以RPMA-1640培养液重悬，配置成1×107cells/ml的细胞悬液。将细胞悬液接种于培养板中，每孔加入细胞及刀豆蛋白A（ConA）100 μl，ConA终浓度为10 μg/ml。37℃和5% CO2培养箱中培养48 h，每孔加入CCK-8试剂20 μl，孵育4 h，酶标仪（450 nm）检测光密度值。

1.3.4 HE染色

将固定48 h后的胸腺和脾脏常规乙醇梯度脱水，石蜡包埋连续切片，片厚5 μm，HE染色，中性树脂封片。股骨固定48 h后置于EDTA脱钙液中（每2天换一次脱钙液），5周完成脱钙。流水冲洗标本，延股骨额状面中央纵剖。进行组织脱水、制片，具体步骤同上。运用Motic光学显微镜和彩色数码CCD摄像头进行形态学图像采集，分别在4×10、10×10、40×10倍视野下观察胸腺、脾脏和骨髓的形态结构变化。

1.4 统计处理

所有数据以M±SD表示，用SPSS 17.0软件进行统计分析。所有测试指标的数据均进行正态分布检验和方差齐性检验。首先将E与C组进行比较，以探讨长期大强度训练对机体免疫机能的影响。然后对比E、E+LL和E+HL 3组，探讨不同剂量的激光对运动性免疫抑制发展过程的调理效果差异。以上统计学分析过程中，各组之间的比较均采用多因素方差分析的方法，分别分析干预措施（运动/激光）的主效应、时间的主效应，以及两者之间的交互效应。当交互效应具有统计学意义时，再进一步采用One-Way ANOVA进行主效应分析（simple main effect），并采用LSD选项进行各组间的两两比较，显著性水平取P＜0.05。

2 研究结果

本研究在干预前（0周）和干预过程中（第2、4、6周末）分别采集各组大鼠的血液，检测血细胞分类计数、免疫球蛋白和补体含量（IgM、IgG、C3、C4）、炎症因子含量（IL-10、TNF-α、IL-10/TNF-α、CRP），并评价脾脏淋巴细胞增殖能力。经多因素方差分析显示，各指标的干预措施主效应、时间主效应，以及它们之间的交互效应均具有统计学意义。且中枢和外周免疫器官的形态在各组之间和各采样时间点之间也存在明显的变化。说明，长期大强度运动可导致机体的免疫机能发生变化，不同剂量的激光照射对这些变化的影响程度不同。

2.1 血细胞分类计数的变化

本研究对血液中白细胞进行了五分类（LY、NE、MO、BA、EO）计数，其中单核细胞、嗜酸性和嗜碱性粒细胞在整个6周递增负荷训练过程中各组大鼠均未出现明显变化，而白细胞总数（WBC）、淋巴细胞（LY）与中性粒细胞（NE）及其比例存在显著改变（图1）。E组从训练的第2周开始，WBC和NE（NE%）进行性上升，而LY（LY%）进行性下降。两个剂量的低强度激光干预组均可延缓WBC、NE（NE%）和LY（LY%）的上述变化趋势，且在训练的后期（第4～6周）E+LL组的效果明显优于E+HL组（P＜0.01）。

2.2 T淋巴细胞增殖能力变化

6周递增负荷训练期间，E组大鼠T淋巴细胞刺激指数（SI）随运动强度增加逐周下降。6周末与0周相比下降29%（P＜0.01）。而E+LL组和E+HL组在训练初期（WK0～WK2）显著下降，随后E+HL组逐周回升，至6周训练结束时，显著高于E组（升高23%，P＜0.01）和E+LL组（升高11%，P＜0.05）。E+LL组4周末时较2周末有所回升，且显著高于E组，6周末时又略有下调，但仍显著高于E组（升高11%，P＜0.05，图2）。

2.3 免疫球蛋白及补体变化

6周递增负荷训练过程中，E组和E+LL组IgM含量随着运动强度增加而增加。6周末时E组和E+LL组显著高于0周基础值（均升高40%，P＜0.01）。而E+HL组于训练初期显著升高（P＜0.05），随后逐周下降，4周末和6周末时显著低于E组和E+LL组（均下降19%，P＜0.05）。6周递增负荷训练过程中，运动各组IgG变化趋势相似：训练初期显著降低（P＜0.01），训练中期与后期显著升高（P＜0.01），其中E组增加幅度最大（6周与0周相比升高20%，P＜0.01）。6周末时，E+LL组显著低于E组和E+HL组（均下降6%，P＜0.01，表1）。

图1 各组大鼠WBC、NE和LY含量及百分比变化Figure 1. The Changes of WBC，NE，and LY in Rats in Different Groups

表1 各组大鼠免疫球蛋白和补体变化情况Table 1 The Changes of Immunoglobulin and Complement of Serum in Different Groups g/L

图2 各组大鼠T淋巴细胞增殖能力的变化Figure 2. The Changes of Proliferation Function of T Lymphocyte of Spleen in Different Groups

补体的数据显示，E组和E+HL组补体C3在训练中期显著升高（P＜0.01）。E+LL组增幅较小（P＜0.05），且显著低于E组（下降24%，P＜0.01）和E+HL组（下降28%，P＜0.01）。各运动组补体C4在训练中期和后期不同程度增加，至6周末时E组和E+HL组较0周均显著升高150%（P＜0.05），而E+LL组增幅不显著，在6周末时显著低于E组和E+HL组（均下降30%，P＜0.01，表1）。

2.4 炎症因子变化

图3显示，E组在6周递增负荷训练过程中，TNF-α和CRP进行性上升，IL-10/TNF-α进行性下降。E+LL组可缩小上述指标的变化幅度，但E+HL组对TNF-α和IL-10/TNF-α的上述变化影响不显著，且使CRP的上述变化进一步扩大。

训练初期E组（下降45%，P＜0.01）和E+LL组（下降28%，P＜0.01）血清IL-10含量显著下降。训练中期和后期，各运动组不同程度增加。6周末时，E+LL组显著高于E组（升高39%，P＜0.01）。

图3 各组大鼠血清相关炎症因子的变化Figure 3. The Changes of Cytokine of Serum in Different Groups

2.5 免疫器官形态结构的变化

2.5.1 中枢免疫器官（胸腺和骨髓）的形态变化

图4显示，C组各周胸腺变化不明显，与图A1、B1、C1相似。胸腺结构完整，皮髓质界限清晰。皮质细胞均匀密集，髓质内上皮细胞连接形成的网状细胞清晰完整。2周末，各运动组（A2、B2、C2）的胸腺皮髓质界限清晰，但皮质中出现断裂带，细胞密度下降且分布不均。4周末，E组（A3）胸腺皮髓质界限模糊，髓质内脂肪细胞增多，细胞间空隙增大，部分出现皮髓质交叉融合现象。E+LL组（B3）和E+HL组（C3）皮髓质界限清晰，且E+LL组细胞密度与2周相比有所增加。6周训练结束后，E组（A4）和E+HL组（C4）胸腺皮髓质交叉融合，断裂带非常明显，上皮细胞散在，网状结构消失，部分存在出血。而E+LL组（C4）虽也出现断裂带，但皮髓质界限清晰可见。

图4 各组大鼠胸腺HE染色（HE×400）Figure 4. The Histomorphology of Thymus in Rats in Different Groups

图5显示，C组大鼠在各采样时点骨髓造血组织结构完整，造血细胞丰富且均匀填充在骨髓腔内，血窦清晰可见（与图5-A1、B1、C1结构相似）。2周末各运动组（A2、B2、C2）骨髓中造血细胞减少，骨髓支架中空腔增多，且向中心聚集。4周末各运动组的骨髓中造血细胞呈现不同程度的增加，其中E+LL组（B3）改善最为明显。6周末E组（A4）和E+HL组（C4）造血细胞减少，骨髓腔空腔增大，而E+LL组（B4）与0周相比空腔仍较多，但造血细胞密度明显高于E组和E+HL组，且与4周相比分布均匀。

2.5.2 外周免疫器官（脾脏）的形态变化

图6显示，C组脾脏形态各采样时点无显著变化，与0周安静对照组（A1、B1、C1）形态结构相似。被膜、白髓（呈紫色）、红髓（呈粉红色）和边缘区界限清晰，中央动脉结构完整，脾小结明显，多为初级滤泡。2周末时，各运动组（A2、B2、C2）的脾脏细胞密度明显下降，脾脏白髓处出现不同程度的断裂带，但白髓、红髓和边缘区界限依然清晰，3组无显著差异。4周末时，E组（A3）白髓、红髓和边缘区界限趋于模糊，细胞密度无明显改善，而E+LL组（B3）和E+HL组（C3）脾脏内细胞密度虽无明显改善，但白髓和红髓界限较清晰。6周末时，E组（A4）和E+LL组（B4）脾脏白髓、红髓和边缘区界限的清晰度下降，部分出现红白髓交差融合现象，而E+HL组（C4）脾脏红白髓界限清晰可见。

3 分析与讨论

本研究通过动态观察（0、2、4、6周）血常规、免疫细胞因子、免疫球蛋白、补体、T淋巴细胞的增殖能力，以及中枢和外周免疫器官的形态等指标的变化，试图探讨长期大强度运动对机体免疫机能的影响。如结果所示，训练初期（WK0～WK2），由于机体对训练的启动和负荷增加的不适应，可产生暂时性的免疫机能下降（表现为CRP升高、IL-10及IL-10/TNF-α下降、T淋巴细胞刺激转化率下降、IgG下降和免疫器官形态的改变等），提示大鼠出现暂时性的免疫抑制。训练中后期（WK2～WK6），由于运动负荷进一步递增以及不施加休息或减量训练调整，大鼠中性粒细胞（NE和或NE%）上升和淋巴细胞（LY和或LY%）下降程度加重，炎症因子（CRP和TNF-α）升高明显，T淋巴细胞增殖功能持续下降，胸腺和脾脏形态的破坏进一步加重，说明大鼠产生累积性免疫抑制。这一阶段运动机体免疫机能大幅度下降，对感染性疾病易感性增高（王建枝 等，2015；Ziv-Baran et al.，2017）。

图5 各组大鼠骨髓HE染色（HE×100）Figure 5. The Histomorphology of Bone Marrow in Rats in Different Groups

图6 各组大鼠脾脏HE染色（HE×100）Figure 6. The Histomorphology of Spleen in Rats in Different Groups

本研究前期已应用同一运动模型，分别从中枢和外周免疫器官的变化等不同层面，探讨了运动性免疫抑制的机制。研究提示，长期大强度递增运动负荷训练可能会导致胸腺细胞周期阻滞（张馨蕾 等，2015）、骨髓B细胞发育障碍（耿青青，2012）、免疫细胞归巢及发育受阻（张琳 等，2013）等。这不仅在一定程度上解释了运动性免疫抑制的机制，也进一步说明，大鼠6周递增负荷训练模型是探讨运动性免疫抑制表现、机制以及干预效果的良好实验模型。

为有效干预运动人群的运动性免疫抑制，我们选取了低强度激光治疗作为主要干预方式进行了实验研究。低强度激光通常是指波长在600～1 000 nm的单色光，具有低输出能量、低光热等效应，能产生某种类似超声波和针灸等物理因子的光生物调节作用，可缓解疼痛、消除炎症、促进愈合（刘承宜 等，2009）。既往研究已经在人体、动物、细胞等多层面发现，低强度激光照射可增加免疫细胞的数量并改善细胞因子的合成与分泌（朱平 等，2011； El Gammal et al.，2017；Garcia et al.，2014）。但目前仍然缺乏针对运动机体（人或实验动物）来探讨运动性免疫抑制激光调理的相关研究。同时，研究和实践也发现，激光照射对机体的免疫调节存在适宜的能量范围，最佳能量密度可改善机体免疫功能，剂量过大则产生相反的效果，造成免疫功能抑制（刘承宜 等，2009；朱平 等，2011）。因此，本研究探讨了不同剂量的低强度激光鼻部照射对EIS发生发展过程的调理作用。

免疫细胞分类计数的实验结果表明，应用低强度激光进行调理，小剂量组在训练的中期和后期呈现明显的调理效果，且在6周末时明显优于大剂量组。而大剂量组在训练中期调理效果显著，但训练后期部分效果消失（NE%、LY%），提示，随着照射时程的延长，大剂量组的激光累积效应增加，可能偏离最适累积剂量范围而导致效果丧失。

血清细胞因子的实验结果表明，CRP对激光剂量反应敏感。大剂量激光与运动可产生强烈的协同效应，表现为大剂量激光组CRP与单纯运动组同步变化且显著高于单纯运动组。而小剂量激光组在训练初期就表现出对CRP的下调作用，虽训练中后期CRP含量有所上升，但在6周末仍显著低于单纯运动组。分析低强度激光的调理效果，综合考虑IL-10、TNF-α及其比值，本研究发现，小剂量激光组在6周递增负荷训练过程中，随着照射时程的延长，调理功能逐渐增大（参考各阶段变化曲线的斜率），而大剂量激光组在训练的中期调理功能最强，训练后期下降。上述实验结果提示，大剂量低强度激光可能具有照射时程（或累积剂量）的抛物线效应，存在最佳时程（或最佳累积剂量）范围。因此，应用不同剂量的激光干预时要考虑疗程和累积剂量的问题，尤其是大剂量低强度激光。

细胞免疫方面的实验结果表明，激光对T淋巴细胞的增殖能力具有调节作用（朱平 等，2011；El Gammal et al.，2017），这可能是激光产生的光生物效应激活了淋巴细胞的MAPK信号通路中的相关酶和受体，影响了细胞内的信号传递系统（Ejiri et al.，2014）。体液免疫方面的实验结果表明，小剂量激光治疗组对IgM未呈现明显的调理作用，但在6周末时对IgG调理有效。大剂量激光治疗组在递增负荷训练的中后期对IgM调理有效，而对于IgG在训练中期调理有效，后期效果消失，提示IgM和IgG对激光照射的应答具有强度依赖性，且随着照射时程的延长，调理作用减弱（尤其是大剂量激光）。一些针对其他健康问题的研究也提供了激光对体液免疫具有调理作用的证据。张红宇等（2001）研究表明，激光穴位照射可有效提高胃癌病人术后血清IgG、IgM、IgA含量。侯晓强等（2005）发现，低强度激光血管照射可有效升高吸毒人员血清IgG、IgM含量。综合上述研究，我们认为激光治疗可有效下调或上调机体感染而导致的IgM和IgG分泌水平变化。这也证明了朱平等人提出的理论假说：低强度激光具有双向调节作用，其治疗的主旨是激发机体产生光生物效应，进而对失衡的状态进行调节，使其恢复稳态或重建新的稳态（刘承宜 等，2009；朱平 等，2011）。

此外，低强度激光对6周递增负荷训练大鼠中枢免疫器官（胸腺和骨髓）形态破坏的改善作用表现为训练初期效果不明显，训练中后期效果显著，且小剂量组优于大剂量组。而对于外周免疫器官（脾脏）则表现为，训练的中后期大剂量组效果优于小剂量组。本研究中免疫器官形态结构的改变支持长期递增负荷训练对机体血液免疫指标的影响以及低强度激光的调理效果。低强度激光对免疫器官的调理作用可能与其光生物效应可维持免疫器官的微环境内稳态，激活相关细胞因子、受体和调控因子，促进造血干细胞的增殖和免疫细胞的分化成熟与定位有关（Barboza et al.，2014；Soleimani et al.，2012；Tuby et al.，2013；Zhu et al.，2017）。本研究选用鼻腔进行低强度激光照射，其主要原因在于：鼻腔内血管网丰富，血流量比肝、脑和肌肉等组织相对较多。且鼻腔中含有丰富的自主神经，刺激鼻腔内的感受器可以反射性改变内脏的活动（如心、肺、胃肠道等）。此外，有研究指出，鼻黏膜固有层和黏膜下层含有很多重要的免疫组织和细胞，低强度激光照射可更好达到血液介导的局部炎症治疗到全身免疫功能改善的光生物学调节效应（Shevrygin et al.，2000）。本研究也证实鼻部的低强度激光照射可产生全身性的光生物调节效应，如引起循环血免疫细胞、免疫因子、抗体和补体，脾脏T淋巴细胞增殖能力，以及中枢和外周免疫器官形态的改变等。既往研究中，对鼻腔和其他部位的照射，都发现其效应可影响到机体的非照射部位或全身。Hentschke等（2012）研究发现，大鼠腓肠肌低强度激光照射，能够使心力衰竭大鼠的全身和骨骼肌产生抗炎作用。Yoshimura等（2016）研究发现，光生物调节作用可改善全身低度炎症，降低胰岛素抵抗。麻晓鸽等（2016）研究表明，低强度激光照射鼻腔能够在一定程度上减轻心肌内炎症浸润和致炎性因子，降低心肌病理程度，抑制心肌细胞的凋亡进程。基于前期研究及上述研究结果所指出的“低强度激光具有全身性的光生物效应”，本研究选取鼻腔照射，通过多指标体系的免疫学观察，探讨低强度激光对运动性免疫抑制的调理效果。

本研究发现，在6周递增负荷训练的初期，小剂量和大剂量的低强度激光均不能有效拮抗这一现象，提示，这一时期应同时采取其他干预手段（如营养等）或进一步探讨适宜的激光干预方案。但伴随训练周期的延长和运动强度的进一步增加，持续的小剂量激光照射对于运动性免疫抑制的发生发展具有显著的改善作用。而大剂量激光在递增负荷训练的中期调理效果明显，但在训练后期调理能力下降，致使部分免疫指标的改善效果减弱或消失（NE%、LY%、TNF-α、IL-10/TNF-α比值、补体C4、IgG），提示，大剂量激光干预可能具有照射时程（或累积剂量）的抛物线效应，即存在最佳的时程（或累积剂量）范围。因此，在应用低强度激光调理机体免疫机能时，应综合考虑受试者的机能状况和需求，以及照射部位、照射剂量和照射疗程等。对于大剂量的激光，可降低照射频率、照射时间、照射疗程，以保证干预效果的最优化。

4 结论

1）6周递增负荷训练模型可有效诱导大鼠产生运动性免疫抑制，其免疫机能的下降是整体性和渐进性的，表现为循环血中白细胞分类计数、免疫细胞因子、免疫球蛋白和补体，脾脏T淋巴细胞增殖能力，以及中枢和外周免疫器官的形态等多层面免疫学指标的动态变化。

2）小剂量的低强度激光对运动性免疫抑制的进展具有持续的拮抗作用，大剂量的低强度激光在训练中期呈现一定的拮抗效果，但训练末期效果减弱或消失，提示，大剂量激光干预可能具有照射时程（或累积剂量）的抛物线效应，即存在最佳的时程或累积剂量范围。

3）大强度训练的初期和中期可选择大剂量激光进行干预，并采取适当的照射频率或照射时间。训练中期和后期应以小剂量激光干预为主，以巩固和加强干预效果。