玻璃化冷冻卵子解冻后ICSI的妊娠结果相关因素

赵志明，曹明雅，赵双丹，周亮，朱序理，王跃

(河北医科大学第二医院生殖医学科，石家庄 050000)

随着冻融技术及卵胞浆内单精子注射技术的发展，大大提高了冷冻卵子的复苏率及受精率，卵子冷冻技术已逐渐应用于临床。但冻融后的卵子存活率、受精率、胚胎着床率及临床妊娠率仍有待提高[1]。哪些因素会影响卵子冻融后的发育潜能，卵子冷冻周期的临床和实验室因素及解冻周期的实验室因素等对卵子的复苏、受精及最终的妊娠结局有无影响作用，还存在争议[2]。本研究回顾性分析卵子冷冻及解冻周期的临床和实验室的各种指标，探讨临床或实验室因素对玻璃化冷冻的成熟卵母细胞解冻移植后的妊娠结局的影响。

资料与方法

一、研究对象

对2012年5月至2018年3月在我院生殖医学科进行卵子冷冻的周期进行回顾性研究，共行90个卵子解冻周期，解冻后行ICSI受精，于受精后第3天行胚胎移植。根据是否妊娠分为妊娠组(44个周期)和未妊娠组(46个周期)。

卵子冷冻指征为：(1)取卵当天获得的卵子数目大于25 枚，且女方配子运送障碍为其不孕原因，在预留足够可用卵子后，冷冻保存部分成熟卵子；(2)取卵当天，无法获得足够可授精的精子，但夫妇拒绝接受供精，冷冻保存其全部或部分成熟卵子。均在充分知情同意的基础上，并经伦理委员会讨论通过。

二、研究方法

1.促排卵方案：采用常规控制卵巢刺激(COS)方案。根据患者年龄、基础性激素水平、窦卵泡数目等卵巢储备功能评价指标选择促排方案。COS过程中，通过超声对卵泡大小进行监测，并以血清性激素水平作为参考，根据卵泡的直径和血清性激素水平决定扳机时机，肌注HCG(珠海丽珠制药)5 000～10 000 U，注射后34～36 h取卵。对女方年龄、不孕年限、COS使用方案、促性腺激素(Gn)用药天数、Gn使用量(支数)、HCG注射日(HCG日)血清雌二醇(E2)水平、获卵数等进行统计分析。

2.脱颗粒及卵子冷冻：预培养获得的卵母细胞，使用透明质酸酶80 U/ml对卵冠丘复合物脱颗粒，酶内时间控制在30 s内。脱颗粒后对卵母细胞进行成熟度的形态学评估。对成熟卵母细胞行封闭载体的玻璃化冷冻。室温操作，冷冻保护剂及时间为(7.5% EG + 7.5% DMSO)平衡5 min，(15% EG + 15% DMSO + 0.2 mol/L蔗糖)至装载时间在70 s内。记录成熟卵母细胞数、取卵至脱颗粒时间(T1)、脱颗粒至冷冻时间(T2)。卵子成熟度=成熟卵母细胞数/获卵数×100%，取卵至冷冻时间(T3)= T1 + T2。

3.卵子解冻及ICSI受精：卵子解冻采用快速解冻方法，步骤为1.0 mol/L蔗糖37℃1 min，0.5 mol/L蔗糖室温2 min，0.25 mol/L蔗糖3 min，10%人血清白蛋白取卵胚胎处理液(HSA G-MOPS，Vitrolife，瑞典)5 min，并逐渐升温至37℃。解冻后评估卵子存活情况，经培养后行ICSI，记录存活卵子数目、解冻至ICSI时间(T4)。卵母细胞存活率=存活卵子数/解冻卵子数×100%。

4.胚胎移植和确定妊娠：ICSI后17 h观察原核确定受精情况，第3天行胚胎评估，并选择优质胚胎进行移植，黄体支持采用黄体酮和(或)HCG。临床妊娠为移植后14 d检测血β-HCG为阳性，并在移植后4周行超声检查可见妊娠囊及原始心管搏动[3]。记录正常受精卵数、优质胚胎数、移植胚胎数、移植胚胎评分。正常受精率=正常受精卵数/ICSI卵数×100%；优胚率=优质胚胎数/正常受精的卵裂数×100%。

三、统计学方法

结 果

所有研究对象解冻卵数766枚，解冻后存活卵数722枚，存活率94.26%；正常受精卵数578枚，正常受精率80.06%；优胚数240枚，优胚率41.52%。移植周期76个，复苏移植率84.44%，移植胚胎数180枚，平均移植胚胎数2.37个，种植胚胎数54枚，种植率30.00%。妊娠周期44个，移植周期妊娠率57.89%，解冻周期妊娠率48.89%。

一、妊娠组和未妊娠组一般临床资料比较

妊娠组女方年龄、不孕年限显著低于未妊娠组，而妊娠组的HCG日E2水平、周期获卵数、成熟卵数显著高于未妊娠组(P<0.05)；妊娠组和未妊娠组COS方案比较，妊娠组长方案较多，未妊娠组拮抗剂方案较多(P<0.05)；两组间Gn用药天数、Gn用药量、成熟卵率无统计学差异(P>0.05)(表1)。

组 别周期数年龄不孕年限用药方案(个)长方案拮抗剂方案超长方案Gn用药天数妊娠组 4428.10±4.90∗4.50±3.50∗40#4#09.70±2.10未妊娠组4632.40±5.906.80±3.601622810.40±2.90组 别周期数Gn用药量(支)HCG日E2(pmol/L)获卵数成熟卵数成熟卵率(%)妊娠组 4425.20±9.2014 598.60±5 181.67#21.70±14.80∗19.50±13.10∗90.74±10.50未妊娠组4631.40±12.009 392.81±6 868.4112.10±10.9011.00±10.8086.16±14.55

注：与未妊娠组比较，*P<0.05，#P<0.01

二、妊娠组和未妊娠组实验室资料比较

90个解冻卵子周期中，未移植周期14个，均为解冻1～4个卵子，其中8个周期无存活卵子，6个周期胚胎质量差未移植。妊娠组脱颗粒至冷冻时间(T2)显著短于未妊娠组(P<0.05)；卵子存活率、正常受精率、优胚数、优胚率、移植胚胎的评分比较，妊娠组均显著高于未妊娠组(P<0.05)；两组间T1、T3、T4、解冻卵数、存活卵数、正常受精卵数、移植胚胎数目均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

三、T1、T2、T3、T4与实验室结局的相关性

T1、T2、T3和T4的时间范围分别是1.13～7.20 h、0.67～5.00 h、3.83～8.47 h和0.50～5.33 h。T1与T2呈负相关(r=-0.615，P=0.000)，与T3呈正相关(r=0.615，P=0.000)；T1与优胚数、优胚率呈正相关，T2与卵子存活率、优胚数、优胚率呈负相关，T3与卵子存活率呈负相关，T4与正常受精率呈负相关；卵子冷冻周期的成熟卵数与解冻卵数、存活卵数、正常受精卵数、优胚数呈正相关，卵子解冻周期的优胚率与存活率、正常受精率、优胚数、移植胚胎评分呈正相关(表3)。

组 别周期数ICSI周期数移植周期数T1(h)T2(h)T3(h)T4(h)解冻卵数存活卵数妊娠组 4444442.90±1.852.82±1.25∗5.72±1.503.76±1.339.30±5.809.10±5.50未妊娠组4638322.39±1.053.66±1.066.05±0.884.18±0.487.70±5.707.00±5.80组 别周期数存活率(%)正常受精卵数正常受精率(%)优胚数优胚率(%)移植胚胎数移植胚胎评分妊娠组 4498.54±2.86∗8.00±4.8089.91±11.00∗3.90±2.60#52.25±20.57∗2.55±0.508.55±2.02#未妊娠组4684.24±30.385.40±4.3070.07±32.771.60±2.0031.06±34.962.13±0.815.50±2.19

注：与未妊娠组比较，*P<0.05，#P<0.01

表3 T1、T2、T3、T4与实验室结局的相关性(r值)

注：相关性分析，*P<0.05，#P<0.01

讨 论

人类卵子冷冻技术成熟的标志是其妊娠率和出生率接近于新鲜周期。但由于人类成熟卵母细胞的自身特点，如形态及结构较胚胎复杂，体积大、含水多，质膜通透性与稳定性差，冷冻过程中由于体积与表面积比较大造成脱水困难易形成冰晶，复苏过程中容易死亡，且纺锤体对冷冻过程的低温非常敏感，影响了染色体的重新排列，从而使卵母细胞冷冻的应用受限[4]。但是玻璃化冷冻技术的应用，对卵母细胞冷冻的普及和发展起到关键作用。目前卵子冷冻主要应用在以下几个方面：(1)促排卵患者取卵日男方取精失败或是不能获得足够用于授精的精子；(2)人类卵子库的建立，为供卵项目提供便利；(3)肿瘤患者治疗前卵子储备；(4)常规卵巢刺激周期中，若获卵多可将部分卵子冷冻保存；(5)避免因胚胎冷冻产生的伦理及立法限制；(6)延迟生育年龄；(7)为卵巢低反应患者累积卵子[5-7]。

许多因素可能影响人类卵子的冷冻结局，如女性的年龄、不孕年限，不同的促排卵方案等。而卵母细胞的体积大小、质量优劣、所处的成熟阶段以及其周围包绕的颗粒细胞等都可能会对卵子冷冻后复苏的存活、受精及随后的卵裂造成极大的影响[8-10]。高质量的卵子冷冻复苏后存活率高，低质量的卵子则复苏存活率低。Rienzi等[11]对450对夫妇的486个周期进行回顾性分析，共2 721枚卵子解冻，复苏率84.7%；共ICSI 2 182枚卵子，受精率和优质胚胎率分别为75.2%和48.1%；周期出生率和移植周期出生率为26.3%和29.4%。通过逻辑回归分析发现，女方年龄、冷冻的卵子数目、移植天数会影响出生率。冷冻卵子数目≤8枚和8枚以上的出生率分别为22.6%和46.4%。年龄>38岁与≤38岁的女性出生率分别为12.6%和27.5%。而当有>8枚卵子且进行囊胚培养移植和卵裂期移植时，年龄>38岁与≤38岁的女性出生率为62.1%和40.7%。本研究发现，妊娠组的年龄、不孕年限、基础FSH水平都比非妊娠组低，而HCG日E2水平、获卵数和成熟卵数比非妊娠组高。随着获卵数、雌激素水平和成熟卵子数目的增加，解冻卵子后可供选择的机会也相应增加，使得正常受精及优质胚胎增多。解冻卵子的正常受精率与冻存前卵子的成熟程度呈正相关，说明卵子成熟程度越高，卵子的质量越好，解冻后卵子的正常受精率越高，优胚数、优胚率也越高，最终移植时胚胎评分越高，胚胎质量也越好，妊娠机会增大。

成熟卵母细胞要在最佳时间受精，因此对冻融卵母细胞的冷冻时间也应严格限制。寻求最佳的冷冻时机及解冻后的ICSI时机可能是提高成熟卵母细胞玻璃化冷冻质量及改善辅助生殖结局的关键。有学者认为成熟卵母细胞玻璃化冷冻的最佳冷冻时机是取卵后2 h内[12]。本研究发现，取卵至脱颗粒时间(T1)与优胚数、优胚率呈正相关，说明适当延长取卵至脱颗粒时间可能增加MII卵子的比例，或是对胞质的成熟有益；但也不能过度延长培养时间，否则会造成卵子老化。妊娠组脱颗粒至冷冻时间(T2)明显短于非妊娠组，分别为2.82 h和3.66 h(P<0.05)；T2与取卵至冷冻时间(T3)正相关，与卵子复苏存活率、优胚数、优胚率呈负相关，说明卵子存活率受时间的影响，脱颗粒后卵子可能发生老化，质量下降，冷冻复苏的效果不好，继而影响优胚率，可供选择的好的胚胎减少。即使存活，形成的胚胎质量也下降，因此适当要缩短脱颗粒至冷冻时间。Porcu[13]也认为，大卵龄的卵子冻存复活率、受精率减低，畸形受精和多倍性增加。此外，冻融卵母细胞的受精时间(不含冷冻保存的时间)为注射HCG后40 h，是行ICSI的最佳时间，可以获得高质量的卵母细胞[14]。研究已证实，玻璃化冷冻成熟卵母细胞解冻后纺锤体的完全重建需要2 h。因此，解冻后的孵育时间应为2 h[15]。目前一般控制解冻至ICSI时间在3 h内，本研究妊娠组解冻至ICSI时间平均为3.76 h。取卵10 h后卵母细胞的发育能力下降。ICSI的代谢老化依赖于：HCG注射后取卵时间，冷冻前预培养时间，解冻到受精时间。取卵后至冷冻前的预培养时间在避免注射老龄卵母细胞上有着重要的作用。冷冻前过度延长培养时间，卵膜渗透率等特性会随着时间改变，可能会影响卵母细胞冷冻后的能力，因此建议卵子必须在取卵后的8 h内进行冷冻保存[13]。

总之，卵子冷冻周期女方年龄及成熟卵数对卵子解冻周期的妊娠结局有重要影响作用。适当延长取卵至脱颗粒时间、缩短脱颗粒至冷冻时间可能通过使卵胞质进一步成熟、降低脱颗粒后卵子老化，而提高卵子解冻存活率及发育潜能。