PHLPP2与Akt表达对NSCLC紫杉醇耐药的临床意义

林玲 陈美芳 吕冬青 葛宏飞

[摘要] 目的 研究PHLPP2在紫杉醇耐药非小细胞肺癌组织中的表达及其与Akt表达的关系。 方法 采用免疫组化方法分别检测160 例非小细胞肺癌组织中的PHLPP2、Akt表达，分析PHLPP2在紫杉醇耐藥组和非耐药组非小细胞肺癌组织细胞中的表达高低及其与Akt表达的关系。 结果 （1）PHLPP2在低中分化肺癌组织内的阳性表达为39.8%，高分化肺癌组织内的阳性表达为70.2%，两者表达存在显著性差异（χ2=13.539，P<0.001）。（2）Akt在Ⅳ期的阳性表达为77.0%，在Ⅲb期的阳性表达为56.7%，两者表达存在显著性差异（χ2=7.297，P<0.05）。在淋巴结转移的阳性表达为83.3%，在无淋巴结转移的阳性表达为44.8%，两者表达存在显著性差异（χ2=25.804，P<0.001）。在不同的分化程度、性别、年龄、肿瘤最大直径、组织学类型的表达差异均无显著性（P>0.05）。（3）PHLPP2表达在TP方案耐药组中低表达率高于非耐药组，差异有统计学意义（P=0.043）。（4）Akt表达在TP方案耐药组中高表达率高于非耐药组，差异有统计学意义（P=0.022）。 结论 PHLPP2可能通过调节Akt水平减少NSCLC对紫杉醇治疗的耐药性。

[关键词] PHLPP2;Akt; 肺癌; 紫杉醇;耐药

[中图分类号] R734.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）17-0028-04

[Abstract] Objective To study the expression of PHLPP2 in paclitaxel-resistant non-small cell lung cancer and its relationship with Akt expression. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of PHLPP2 and Akt in 160 non-small cell lung cancer tissues. The expression of PHLPP2 in paclitaxel-resistant and non-resistant NSCLC tissues， and its relationship with the expression of Akt were analyzed. Results （1）The positive expression of PHLPP2 was 39.8% in poor and middle-differentiated lung cancer tissues， and 70.2% in well-differentiated lung cancer tissues. There was significant difference between the two expressions（χ2=13.539， P<0.001）. （2）The positive expression of Akt in the stage Ⅳ group was 77.0%， and the positive expression in the stage Ⅲb group was 56.7%. There was a significant difference between the two groups（χ2=7.297， P<0.05）. The positive expression of Akt was 83.3% in the lymph node metastasis group and 44.8% in the no lymph node metastasis group. There was a significant difference between the two groups（χ2=25.804， P<0.001）. There were no significant differences in tumor maximum diameter and the expression levels of histological type between different differentiation groups， gender groups， age groups（P>0.05）. （3）The low expression rate of PHLPP2 expression in the TP regimen resistant group was higher than that in the non-resistant group （P=0.043）. （4） The high expression rate of Akt expression in the TP regimen resistant group was higher than that in the non-resistant group， with significant difference（P=0.022）. Conclusion PHLPP2 may reduce the resistance of NSCLC to paclitaxel treatment by regulating Akt levels.

[Key words] PHLPP2; Akt; Lung cancer; Paclitaxel; Drug resistance

肺癌为人类最常见的恶性肿瘤，大多患者在确诊时已经是晚期，化疗是晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的主要治疗手段。紫杉醇为肺癌常用的化疗药物之一，但是化疗耐药一直是导致其治疗失败的主要原因，也是目前治疗的难点[1]。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT/mTOR信号通路中重要的信号转导蛋白，有研究证实[2]Akt活化与肺癌细胞对紫杉醇的耐药有关。PHLPP（PH domain leucine-rich repeats protein phosphatase）是一个新的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，其所编码的PHLPP蛋白可以脱下Akt疏水基团的磷酸分子，使Akt失活，成为Akt的负调节物[3]。PHLPP2为PHLPP家族的同工酶之一。为探索PHLPP是否可通过调节Akt水平以减少NSCLC对紫杉醇治疗的耐药性，本实验以 PHLPP2和Akt为观察指标，通过检测紫杉醇耐药组和非耐药组NSCLC组织中免疫组化表达变化，观察PHLPP2和Akt两者的关系及与紫杉醇耐药发生的相关性。

1 材料与方法

1.1材料来源

2015年1月～2017年12月本院病理组织库采集的160例非小细胞肺癌均经病理诊断明确。其中男100例，女60例，年龄43～72岁，平均55.3岁，鳞癌80例，腺癌80例。依据 2009 年国际肺癌研究会（IASLC）第7版肺癌TNM 分期标准[4]，其中Ⅲb期60例，Ⅳ期100例。高分化57例，中低分化103例。标本为肺癌组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。所有病例均有可评价病灶，全身功能状态（ECOG）评分≤2分。

1.2 方法

随机分为两组，每组各80例。试验组给予紫杉醇/顺铂（TP）方案：顺铂25 mg/（m2·d），静滴，第1～3天，21 d为一个周期;紫杉醇175 mg/m2，静滴，第1天。2个周期后评价疗效。对照组给予吉西他滨/顺铂（GP）方案：吉西他滨1 g/m2，静滴，第1天、第8天;顺铂25 mg/（m2·d），静滴，第1～3天，每3周1次。2个周期后评价疗效。PHLPP2与Akt免疫组化测定采用PowerVision二步法，按试剂盒说明书进行操作。已知PHLPP2与Akt阳性的癌组织作为阳性对照，PHLPP2与Akt蛋白免疫组化阳性细胞判定标准，参照文献[6]由一名高年资病理科主任医师与一名高年资病理科主治医师双盲法统计结果。阳性表达呈棕黄色颗粒染色，主要定位于胞浆内。在癌巢组织中，计算阳性癌细胞数占总癌细胞数的百分比，阳细胞≥25%为阳性，<25%为阴性。染色结果根据着色强度用四分层进行计数（阴性=0，最弱=1，中度=2，强=3）。0～1分为低表达，2～3分为高表达。

1.3 主要试剂

抗PHLPP2兔单克隆抗体（货号：ARG53458）规格：100 μL、抗Akt兔多克隆抗体（货号：ARG56418）规格：50 μL，均由台湾arigo公司提供，2℃～8℃ 储存。

1.4 疗效判定标准

化疗2个疗程结束后按照RECIST1.1评价标准判定[5]。淋巴结短轴值> 15 mm是可测量病灶。CR：所有靶病灶完全消失，病理性淋巴结短轴值<1.0 cm;PR：靶病灶最大长径之和在4周内持续减少 30.0%以上;PD：最大长径之和增加20.0%以上或有新病灶出现;SD：目标病灶最大长径之和减少低于30.0%或增加不足20.0%。以取得CR或PR为化疗敏感，否则为耐药。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件包进行统计分析，蛋白表达与临床病理指标关系采用χ2检验，两蛋白表达之间的比较采用Spearman等级相关检验进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PHLPP2与Akt的表达及与临床病理参数间的关系

PHLPP2阳性表达呈棕黄色颗粒染色，主要定位于胞浆内，细胞间隙也可见其阳性染色，见封三图1。Akt阳性表达呈棕黄色颗粒染色，主要定位于胞浆内，细胞间隙也可见其阳性染色，见封三图2。根据免疫组化结果判断标准，160例肺癌组织内PHLPP2阳性表达81例，阳性率为50.6%，肺癌组织内Akt阳性表达111例，阳性率为69.4%，见表1。PHLPP2在低中分化肺癌组织内的阳性表达为39.8%，高分化肺癌组织内的阳性表达为70.2%，两者表达存在显著性差异（χ2=13.539，P<0.001）;在不同的性别、年龄、肿瘤最大直径、TNM分期、组织学类型、淋巴结有无转移的表达差异均无显著性（P>0.05）。Akt在Ⅳ期的阳性表达为77.0%，在Ⅲb期的阳性表达为56.7%，两者表达存在显著性差异（χ2=7.297，P<0.05）;在淋巴结转移的阳性表达为83.3%，在无淋巴结转移的阳性表达为44.8%，两者表达存在显著性差异（χ2=25.804，P<0.001）;在不同的分化程度、性别、年龄、肿瘤最大直径、组织学类型的表达差异均无显著性（P>0.05）。

2.2 PHLPP2与Akt在TP与GP化疗方案耐药及非耐药组中表達程度及相关性

PHLPP2表达在TP方案耐药组中低表达率高于非耐药组，差异有统计学意义（P=0.043<0.05）;Akt表达在TP方案耐药组中高表达率高于非耐药组，差异有统计学意义（P=0.022<0.01）。见表2。PHLPP2与Akt表达在GP方案耐药组与非耐药组中差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3 讨论

紫杉醇作为一种微管靶向抗肿瘤药物，为肺癌常用的化疗药物之一，在肺癌治疗上具有良好的疗效而广泛使用，但是肿瘤细胞对紫杉醇产生耐药是治疗失败的重要原因[7]。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K/Akt信号转导通路的核心因子，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。有研究证实Akt信号通路与多种肿瘤的化疗耐药和预后有关[8，9]，PI3K/Akt/mTOR信号通路在恶性肿瘤发生、侵袭、转移及化疗耐药中具有重要的影响，其作用主要是促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进肿瘤血管生成[10-12]。在肺癌组织中，Akt信号通路被明显活化，并且P-Akt呈现高表达[13]。国内研究[14]显示紫杉醇耐药肺癌A549细胞（A549/T细胞）在用 AS1411处理后Akt的蛋白水平均有下调，细胞的活性与克隆形成能力都受到抑制，同时细胞凋亡数目增加，该研究提示Akt的活化与肺癌细胞对紫杉醇的耐药有关。体外试验研究[15]证明了紫杉醇能激活ERK1/2通路诱导大肠癌细胞凋亡。PHLPP 是一个新的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，PHLPP2基因定位于16号染色体，是PHLPP家族中三个同工酶中的其中一个。Gao等[3]2005年发现其所编码的PHLPP蛋白可以脱下Akt的疏水基团Ser473位点一个磷酸分子，PHLPP蛋白可以脱下Akt的疏水基团Ser473位点一个磷酸分子，使Akt失活，拮抗细胞内P13K/Akt信号通路，具有抑制肿瘤细胞生长与迁移能力，促进细胞凋亡的作用，证实其为肿瘤抑制基因的角色。

PHLPP已经被证明能使Akt脱去磷酸后失去活性，从而成为Akt的负调节物[16]。有研究在H157细胞（NSCLC细胞）和乳腺癌细胞发现PHLPP的超表达导致Akt活性降低，使得细胞凋亡增加，然而PHLPP的敲除使得Akt活性增加，使得细胞凋亡减少[17]。同时发现PHLPP在慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤呈现低表达，并且恶性胶质瘤患者的PHLLP表达越高，其存活率也越高[18]。在结肠癌的研究中也证实了PHLPP是一种肿瘤抑制因子，J Liu等报道了PHLPP二个同工酶在结肠癌标本和临近正常组织中免疫组化的表达，发现PHLPP1和PHLPP2在肿瘤组织中丢失或者减少分别是78%和86%，同时PHLPP在结肠癌细胞的超表达能减少细胞增殖，并且通过抑制Akt信号通道能很大程度地抑制细胞生长[19]，从而表明PHLPP参与肿瘤生长的负性调节作用，提示PHLPP作为肿瘤抑制因子将有可能用于Akt水平升高的癌症治疗。PHLPP2通过PI3K/Akt信号传导通路抑制细胞周期进展并促进肺癌细胞的凋亡[20]，但PHLPP2在肺癌组织中的表达谱尚不清楚。研究已确定 PHLPP2基因是终止致癌Akt信号传导特异性和有效的必需磷酸酶[21]。

本研究发现PHLPP2在低中分化肺癌组织内的阳性表达率较高分化的表达低，提示PHLPP2的低表达可能促进肿瘤的恶性分化程度。Akt在Ⅳ期的阳性表达较Ⅲb期高，和肺癌晚期肿瘤分期相关。Akt阳性表达和有无淋巴结转移亦存在相关性，与研究一致[22-24]，考虑Akt的高表达与肿瘤细胞的侵袭和转移有关。PHLPP2表达在TP方案耐药组中低表达率明显高于非耐药组，Akt表达在TP方案耐药组中高表达率明显高于非耐药组，而PHLPP2与Akt表达在GP方案耐药组与非耐药组中表达无统计学差异。

综上所述，我们认为Akt的活化与肺癌细胞对紫杉醇的耐药可能有关，PHLPP2可能通过调节Akt水平减少NSCLC对紫杉醇治疗的耐药性。该研究局限于病理组织，本团队将进一步探索在细胞学方面的耐药机制试验。

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（收稿日期：2019-03-18）