荸荠种杨梅的疏果和落果功能性成分研究

刘 清，倪 穗

(宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211)

杨梅(MyricarubraSieb.et Zucc)是杨梅科(Myricaceae)杨梅属(Myrica)的常绿乔木[1]。它是我国南方著名的特产类水果。吴耕民先生称其果为“中国特产的初夏江南珍果”[2]。我国是杨梅的主产国，杨梅的种植面积占世界总栽种面积的 98.5% 以上，主要分布在浙江、江苏、福建、广东等南方的省份。荸荠种杨梅因果实成熟时色泽呈紫黑色像荸荠而得名。营养丰富、具生津止渴、利消化的作用,具有较高的药用价值和经济价值[3-7]。

杨梅的结实率非常强，为了保证杨梅品质，在杨梅挂果的前期会进行适当的疏果，一般会疏掉结果量的 40%～60%，使每个枝条上保持2到3个果实，这个疏果措施对杨梅果实单果重的提高作用很大。同时，杨梅在果实成熟前(一般采前约20天内)和成熟时通常会出现大量的落果，这是因为在果实转色后趋向生理完熟过程中，核果肉柱内的乙烯含量持续增加，果实呼吸作用增强，果柄与果枝的接合部产生离层内源激素脱落酸不平衡,在不受外力，或生产农事轻轻摇晃,或自然风雨作用下而形成落果，落果率一般5%-50%[8]。

近年来，国内对杨梅的研究重点在于如何保鲜，延长杨梅的贮藏期，也有对杨梅进行产品开发[9-12]。而对疏果的研究在于如何合理进行疏果，减少人工成本费用；对落果的研究在于如何防控落果，减少落果率。鲜有对杨梅疏果和落果的开发利用研究。而杨梅疏果和落果的量较大，不加以利用是对资源的大量浪费，而且疏果落果腐烂后会引起病害和污染环境。因此，本文针对杨梅的疏果和落果进行开发利用，旨在变废为宝解决杨梅疏果和落果的资源浪费和污染环境的问题及增加果农的收入。

1 实验材料

1.1 实验材料

取自慈溪市横河疏果期、落果期的荸荠种杨梅果，将新鲜的杨梅去核，分别进行真空冷冻干燥48 h，置于-18℃贮藏备用。

1.2 主要试剂及仪器

主要试剂：标准品芦丁、标准品柠檬酸、标准品苹果酸、标准品没食子酸(生化试剂，中国药品生物制品检定所出品)、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、盐酸、磷酸(分析纯)、2N福林试剂(Folin reagent)、碳酸钠、磷酸二氢钾(上海国药集团化学试剂公司)。

主要仪器：RF-5301PC型可见分光光度计(日本岛津公司)；组织匀浆机(飞利浦公司)；FD-1C-50型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；PL203电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；FW80高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；Anke TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)；Waters2695型高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器；Empower色谱工作站；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)；XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)； PH计(上海埃依琪实业有限公司)。

2 实验方法

2.1 黄酮类化合物测定

2.1.1 标准曲线的绘制

将芦丁于120℃下干燥至恒重，精确称取芦丁标准品 0.02 g，用 95%乙醇溶解，并定容于100 m L容量瓶中。准确吸取标准品溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 m L，置于 25 mL容量瓶中，加入2.5 ml蒸馏水，1.25 mL 5%的NaNO2，摇匀后静置6 min；加入1.25 mL 10%的Al(NO3)3，再摇匀静置6 min后，加入6.25 mL 5%的NaOH；然后加水至25 mL，摇匀静置15 min，在510 nm波长下测定不同浓度的芦丁的吸光度。

2.1.2 样品处理与测定

称取1.0 g 干燥的杨梅粉放于50 mL的离心管中，按料液比1∶10(g/m L)加入浓度为70%的乙醇，常温下超声萃取30 min，频率为350 Hz，然后3000 r/min离心10 min，分离上清液和沉淀，重复提取2次，合并上清液定容到10 ml得到供试品。

准确吸取0.5 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，加入2.5 ml蒸馏水，1.25 mL 5%的NaNO2，摇匀后静置6 min；加入1.25 mL 10%的Al(NO3)3，再摇匀静置 6 min 后，加入 6.25 mL 5%的NaOH；然后加水至 25 mL，摇匀静置 15 min，在 510 nm波长下测定不同浓度的芦丁的吸光度在 510 nm波长下测定不同浓度的芦丁的吸光度，三组平行实验。

2.2 总酚的测定

2.2.1 标准曲线的绘制

准确称取0.2 g没食子酸，用蒸馏水定容至100 mL，从中吸取5 mL，用蒸馏水定容至100 mL，即得0.1 mg/mL的没食子酸对照品溶液。分别准确吸取没食子酸溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、2.0 mL放置在50.0 mL的容量瓶中，然后加入4 mL蒸馏水，摇匀，加入0.5 mL福林酚溶液，摇匀，静置1 min，加入1.5 mLNa2CO3(200 g/L)，然后用蒸馏水定容至50 mL，摇匀，放在暗处反应两小时，用试剂作空白参照试验，在765 nm下测其吸光度。

2.2.2 样品处理与测定

称取1.0 g干燥的杨梅粉放于50 mL的离心管中，按料液比1∶20(g/m L)加入乙醇，常温下超声萃取1 h，频率为350 Hz，然后3000 r/min离心10 min，分离上清液和沉淀，重复提取2次，合并上清液定容到20 ml得到供试品。

准确吸取0.2 mL杨梅多酚萃取液，加4 mL蒸馏水和0.5 mL福林-酚试剂混匀，放置3 min，然后加1.5 mL 20%的Na2CO3，用蒸馏水定容到50 ml，混匀，在暗处放2 h，测定765 nm处吸光度值。设置3个平行实验，取其平均值。

2.3 总酸的测定

2.3.1 溶液的配制

0.1000 mol.L-1NaOH溶液:称取4.000 g NaOH,加水溶解,定容至1 L。

麝香草酚酞指示剂:称取麝香草酚酞1 g,溶于适量乙醇中再稀释至100 ml。

酚酞指示剂:称取酚酞1 g,溶于适量乙醇中再稀释至100 ml。

2.3.2 滴定NaOH标准溶液

准确称取约0.6 g在105一110℃干燥至恒量的基准邻苯二甲酸氢钾,加80 ml新煮沸过的冷水,使之尽量溶解,加2滴酚酞指示液,用已标定的NaOH溶液滴定至溶液呈粉红色5 min不褪色。

NaOH标准滴定溶液的浓度按下式计算:c3=m/(V1一V2)*0.2042

c3-NaOH标准滴定溶液的实际浓度(mol/L)； m-基准邻苯二甲酸氢钾的质量(g)；Vl-NaOH标准滴定溶液的用量(ml)；V2-空白实验中NaOH标准滴定溶液用量(ml)；0.2042-与1.0 ml氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH)=lmol/L]相当于基准邻苯二甲酸氢钾的质量(g)

2.3.3 样品制备与测定

杨梅汁用活性炭除色后准确吸取样品10 ml于50 ml锥形瓶中,加入1%麝香草酚酞指示剂3滴,用NaOH标准液滴定至显蓝色。

总酸度以柠檬酸计算，g/100mL=V*c3*0.07*100/W

V-消耗NaOH溶液的毫升数(ml)；N-NaOH溶液当量浓度(mol/L)；W-样液体积(ml)；0.070-1 mol氢氧化钠标准溶液1毫升相当于柠檬酸(含1分子水)克数

无水柠檬酸的换算系数为0.064,醋酸(0.060),酒石酸(0.075),乳酸(0.09),苹果酸(0.067)。

2.4 柠檬酸、苹果酸测定

2.4.1 标准曲线的绘制

取苹果酸 513.0 mg、柠檬酸 494.9 mg置于10 m L 棕色容量瓶中，用流动相溶液溶解并定容至刻度，得到苹果酸浓度为0.513 mg/L、柠檬酸浓度0.4949 mg/L。

分别取0.01 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL用流动相定容到10 mL。分别配制浓度为0.513、2.565、5.13、10.26、20.52、30.78、41.04、51.3 ug/L的苹果酸(标准品纯度98%)和浓度为 0.4949、2.4745、4.949、9.898、19.796、29.694、39.592、49.49 ug/L的柠檬酸(标准品纯度99.5%)的有机酸标准溶液以液相色谱分析条件进样分析，根据浓度与峰面积的对应关系分别制作标准曲线。

2.4.2 样品处理与测定

杨梅去核、搅碎、匀浆。称取12.5 g 于25 mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容， 旋涡振荡 2 min，超声提取30 min，过滤。取一定量的滤液以10000 r/min高速 离心10 min，分离沉淀蛋白质、果胶等干扰物质，取上清用0.45 μm 孔径的滤膜过滤2次，滤液供上机分析，分析时进样10 μL。

3 结果与分析

3.1 回归方程和相关系数

黄酮类化合物、总酚用分光光度法进行检测，有机酸种类及含量采用高效液相色谱法进行检测，其线性关系。相关系数和线性范围如表1所示。

表1 回归方程、相关系数和线性范围

由表1可知,黄酮类化合物、总酚和柠檬酸、苹果酸在各自的浓度范围呈良好的线性关系。

3.2 荸荠种杨梅主要功能性成分的含量

通过分光光度法检测黄酮类化合物、总酚；高效液相色谱法检测柠檬酸、苹果酸等；酸碱滴定法检测总酸等功能性成分，其结果如表2所示。

表2 荸荠种杨梅的疏果和落果主要功能性成分含量

注：肩标不同字母表示在p=0.05水平下差异显著。

荸荠种杨梅的疏果和落果的主要功能性成分含量如表2所示，从表中可以看出，疏果和落果中功能性成分的含量不同。 疏果的黄酮类化合物含量56.15 mg/g与落果的黄酮类化合物含量39.88 mg/g存在显著差异；疏果的总酚含量28.16 mg/g与落果的总酚含量19.33 mg/g存在显著差异；疏果的柠檬酸含量35.888 mg/g与落果的柠檬酸含量8.76 mg/g存在显著差异；疏果的苹果酸含量1.378 mg/g与落果的苹果酸含量0.939 mg/g存在显著差异；总酸含量3.5%高于落果1.1%。

4 讨论

杨梅生长发育时期分为：幼果期、硬果期、破色期、红熟期、暗红期[13]。疏果属于杨梅的幼果期，落果属于杨梅的暗红期。梁森苗[14]等的研究了荸荠种果实发育过程中主要营养成分的形成规律。表明荸荠种的总酸、柠檬酸、苹果酸含量在发育生长过程中均呈现出先缓慢上升后迅速下降趋势，但幼果期的总酸含量高于成熟期，且在成熟期总酸含量达到最低点；而黄酮类化合物变化趋势总体呈现倒V型，幼果期的含量达到最大；总酚含量在幼果期最高，破色期是总酚含量下降的转折点，红熟期之后略有升高直到暗红期保持稳定。

本文对荸荠种杨梅的总酸、柠檬酸、苹果酸研究与前期对其他品种的研究结果相似[15-16]。疏果的柠檬酸、苹果酸含量均高于落果，而杨梅中总酸是以柠檬酸含量计算，其含量主要受到柠檬酸的影响，所以其规律与柠檬酸基本一致，及疏果总酸含量高于落果含量。可滴定酸含量、总酚类含量与感官评价中的酸味、涩味强度有一定的关联，总酚化合物中的单宁是造成涩味的主要成分物质。幼果期杨梅口感酸涩，疏果总酸、总酚含量最高，随着杨梅果实的成熟，总酸、总酚含量逐渐降低，杨梅的糖类物质积累，糖酸比变大，口感变为酸甜。黄酮类化合物含量与程海燕[17]等的超声波提取荸荠种黄酮类化合物的最佳工艺条件：乙醇浓度为70%，提取时间为30 min，料液比为1∶10，提取溶剂PH=3下的含量差异较大。表明不同产地、不同提取工艺对黄酮类化合物的得率的有显著性的差异，以后可对此进行进一步的探究验证。本文落果中总酚含量(19.33±0.02 mg/g)与解红霞[18]研究的不同干燥方式中冷冻干燥杨梅的总多酚含量(24.49±6.00 mg/g)差异不大，表明冷冻干燥对杨梅的营养物质损失率较小。落果中总酸含量1.1%与潘向荣[19]研究杨梅总酸度的结果差异性不大。表明采用常规的酸碱滴定法对杨梅总酸度的测定结果比较准确。 落果中柠檬酸和苹果酸含量与刘文静[20]采用反相高效液相色谱法测定不同品种杨梅的含量差异很大，分析其原因可能是由于品种不同、测定采用的方法不同导致其含量差异较大，但有机酸是以柠檬酸和苹果酸为主。

黄酮类化合物、总酚等有多种重要的生理功能，可以用作抗氧化剂、植物生长调节剂、抑菌剂。本文测定了荸荠种杨梅的疏果和落果的主要功能性成分含量，幼果期的杨梅主要功能性成分的含量均高于成熟期。采用分光光度法测定疏果黄酮类化合物(56.15±0.03mg/g)、总酚含量(28.16±0.01 mg/g)高于落果黄酮类化合物(39.88±0.02 mg/g)、总酚含量(19.33±0.02 mg/g)；采用酸碱滴定法测定疏果总酸含量(3.5%)高于落果含量(1.1%)；采用高效液相色谱法测定疏果柠檬酸(35.888±0.06 mg/g)、苹果酸含量(1.378±0.02)高于落果柠檬酸(8.76±0.04 mg/g)、苹果酸含量(0.939±0.01 mg/g)。本文研究结果为杨梅疏果和落果的综合开发利用提供一些有益的参考。