声脉冲辐射力弹性成像评估肝纤维化程度的动物实验研究

童瑾，曹春莉，马婷，刘闪闪，康燕飞，徐丽红，杜婷婷，李军

慢性肝脏疾病是严重危害人类健康的常见病，在世界范围内有较高的病死率和发病率［1］。慢性肝脏疾病可引起持续、反复的肝实质炎性反应及坏死，使肝脏内弥漫性细胞外基质过度沉积而降解不足进而形成肝纤维化。作为各种慢性肝脏疾病向肝硬化转变的必经阶段，肝纤维化在反映病情严重程度和预后情况方面具有重要意义［2］。研究发现早期治疗可以延缓肝纤维化的进展速度［3］。另有研究报道肝纤维化病理分期中F1、F2期的治疗效果较好，病情可以完全逆转，F3、F4期的治疗效果较差［4］。目前肝纤维化程度的诊断方法主要有肝穿刺活检术、血清学标志物等，但各诊断方法又各有其缺陷，肝穿刺活检术因其有侵入性、存在取样误差等而难以广泛开展［5-6］。血清学标志物检测操作简便、过程具有可重复性、结果客观，但目前尚未发现单一血清学标志物能准确评估肝纤维化程度。因此非侵入性、简单易行、诊断效能高的肝纤维化评估方法成为近年的研究热点。

声脉冲辐射力弹性成像（ARFI）作为一种新的弹性成像技术，因其能无创而有效地评估组织弹性，在临床上得到广泛应用，并且已经飞速发展成为医学超声影像技术研究的前沿和热点［7-10］，其通过测量感兴趣区（ROI）的剪切波速度（SWV）来评估组织弹性，即组织的硬度或质地，已广泛应用于腹部及浅表器官疾病的定性诊断。有研究发现ARFI在评估肝纤维化程度方面具有一定的诊断价值［11-12］，提示可以用来评估肝纤维化的严重程度。

本研究构建了不同程度的兔肝纤维化模型，进行ARFI检查，将此方法获得的弹性参数与所测肝纤维化病理分期进行对照研究，寻找能准确评价肝纤维化程度的指标，并获取该参数的截断值，为临床诊断及治疗肝纤维化提供理论依据。

本研究价值：

肝纤维化是肝硬化、肝细胞癌的前期病变，肝穿刺活检术是肝纤维化病理分期诊断的金标准，但此方法具有侵入性、临床禁忌证多等缺点而限制了其在临床的广泛应用，本研究通过建立兔肝纤维化模型，探讨了应用声脉冲辐射力弹性成像（ARFI）评估兔肝纤维化程度的诊断价值，发现ARFI对肝纤维化具有较高的诊断效能，值得临床推广应用，为临床无创评估肝纤维化程度提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 兔肝纤维化模型的建立方法 2015年4—10月，选用健康新西兰大白兔44只，随机选取36只作为实验组，8只作为对照组。实验组给予皮下注射四氯化碳（CCl4）16周建立兔肝纤维化模型，起始剂量为0.3 ml/kg，剂量递增，第4周剂量为0.4 ml/kg，第5周后剂量为0.5 ml/kg；对照组给予相同剂量0.9%氯化钠溶液。

1.2 ARFI检查活体兔肝硬度 活体兔ARFI检查使用西门子公司生产的Acuson S2000彩色多普勒超声诊断仪，9L4探头，频率4～9 MHz，配置VTQ定量分析系统，于造模第4、6、8、10、12、14周，分别从实验组随机选取3～6只兔，对照组随机选取1～2只兔，造模第16周选取剩余的实验组及对照组兔进行检查。所有需行检查的兔当日禁食水，保证至少空腹8 h。8%水合氯醛盐溶液2 ml/kg耳缘静脉缓慢推注。麻醉后仰卧位固定于兔台，使用电推剪剃掉其腹部毛发，范围为上至胸骨中段，下至耻骨联合，充分暴露其腹部后做好保温措施，即刻将其送至腹部彩超室接受检查。检查过程中保证其固定良好，探头涂抹足量耦合剂，由同1名高年资超声医师对所有受试兔进行超声检查，包括常规超声检查及ARFI检查，即先用二维超声检查兔肝脏，观察整体肝脏声像图，常规超声检查包括肝脏大小、形态、轮廓、表面、边缘状态、实质回声。在二维超声检查的基础上，选取肋缘下肝切面为检测部位并固定探头，采用ARFI检测兔肝脏横向SWV（m/s）。ROI的选择应避开肝内管道系统，取样深度为0.5～2.0 cm，检测10次，记录数据并留取检测图像。

1.3 ARFI检查离体兔肝硬度 活体兔肝SWV检测完成后，快速结扎兔肝脏血管及周围韧带并游离出兔肝脏，然后取出兔肝在肝右叶行ARFI检查。离体兔肝SWV记为SWV1，测量深度距肝包膜0.5～2.0 cm，检查10次，记录数据并留取检测图像。

1.4 兔肝组织学检查与肝纤维化病理分期诊断 SWVI测量完成后，使用空气栓塞法处死兔，取测量取样框所置部位的肝组织标本，先使用兔苏木素-伊红（HE染色）染色再进行Masson染色法染色，染色后的切片均由病理科主治医师及以上职称的医生独立盲法阅片诊断。肝纤维化分期标准依据Metavir分期法［13］（2000年全国病毒性肝炎病理诊断标准）分为0～4期，F0期：无纤维化；F1期：汇管区纤维化但无纤维间隔形成；F2期：汇管区纤维化有少许纤维间隔伴生；F3期：大量纤维间隔形成；F4期：肝硬化，假小叶形成，伴或不伴炎性坏死。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0及Excel 2003软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，不同肝纤维化病理分期组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。绘制SWV、SWV1评估肝纤维化的受试者工作特征（ROC）曲线，计算ROC曲线下面积（AUC），确定截断值、灵敏度、特异度。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔肝纤维化病理学分期 造模期间的死亡兔肝组织表面光滑，质地较软，病理检查显示不同程度肝细胞肿胀、坏死，未见肝纤维化形成。至造模第16周时，成功建立各分期的兔肝纤维化模型（见表1）。病理检查结果示：对照组兔肝脏病理学检查均正常，无纤维化；实验组36只兔最终死亡4只，造模成功32只，肝纤维化分期为F1期6只、F2期10只、F3期8只、F4期8只（见图1），造模成功率为88.9%（32/36）。

2.2 ARFI检查兔肝纤维化硬度 实验组32只造模成功兔及对照组8只兔均完成ARFI检查并成功获取活体兔肝SWV及离体兔肝SWV1。对照组和实验组肝纤维化各期SWV、SWV1比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；其中实验组F1～F4期的SWV、SWV1大于对照组，实验组F2～F4期的SWV、SWV1大于实验组F1期，实验组F3～F4期的SWV、SWV1大于实验组F2期，实验组F4期SWV1大于实验组F3期，差异均有统计学意义（P＜0.05）；对照组及实验组F1～F4期SWV1均大于SWV，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2，图2～3）。

2.3 ARFI评估兔肝纤维化程度的诊断效能 ARFI诊断肝纤维化分期≥F2期、≥F3期及F4期的AUC均＞0.9，SWV诊断肝纤维化≥F2期、≥F3期及F4期的截断值分别为2.21、2.29、2.36 m/s，灵敏度分别为80.8%、87.5%、87.5%，特异度分别为83.3%、87.5%、79.3%；SWV1诊断肝纤维化≥F2期、≥F3期及F4期的截断值分别为2.58、2.92、3.26 m/s，灵敏度分别为80.8%、81.3%、87.5%，特异度分别为83.3%、87.5%、95.8%（见表3、图4～6）。

3 讨论

本研究采用皮下注射CCl4的方法成功制备了兔肝纤维化各期模型，实验组兔造模成功率为88.9%。采用皮下注射CCl4的方法制备兔肝纤维化模型具有稳定性好、成模率高等特点，适合推广使用。

ARFI融合了生物力学和影像学的技术，是目前较新的能定量评估组织硬度的方法［14-16］。ARFI通过测量其横向SWV来间接反映ROI肝组织的硬度，在检查中不受肋间隙狭窄及肥胖的限制［17］。研究发现ARFI弹性参数SWV与病理肝纤维化分期间有较好的相关性，SWV随肝纤维化的加重而增加，提示SWV可用于评估肝纤维化程度［16］。

表1 造模后不同时间点兔肝纤维化分期（只）Table 1 Staging of liver fibrosis of rabbits in experimental group sacrificed between the 4th and the 16th weeks of modeling

表2 对照组和实验组兔纤维化各期SWV、SWV1比较（±s，m/s）Table 2 Comparison of the value of SWV and SWV1 in different stages of liver fibrosis

表2 对照组和实验组兔纤维化各期SWV、SWV1比较（±s，m/s）Table 2 Comparison of the value of SWV and SWV1 in different stages of liver fibrosis

注：SWV为活体兔肝剪切波速度，SWV1为离体兔肝剪切波速度；与对照组比较，aP＜0.05；与实验组F1期比较，bP＜0.05；与实验组F2期比较，cP＜0.05；与实验组F3期比较，dP＜0.05；与SWV比较，eP＜0.05

组别 只数 SWV SWV1对照组 8 1.12±0.05 1.33±0.04e实验组F1期 6 1.95±0.11a 2.29±0.06ae F2期 10 2.23±0.12ab 2.80±0.21abe F3 期 8 2.39±0.05abc 3.09±0.20abce F4期 8 2.50±0.06abc 3.59±0.10abcde F值 333.536 262.636 P值 ＜0.001 ＜0.001

图1 兔肝纤维化病理分期检查结果（Masson染色，×40）Figure 1 Pathological fibrosis staging in rabbits'liver tissue

图2 ARFI检查活体兔肝SWV结果Figure 2 Elastic parameters SWV of live rabbits detected by ARFI

图3 ARFI检查离体兔SWV1结果Figure 3 Elastic parameters SWV1 of rabbits' liver in vitro detected by ARFI

表3 ARFI诊断兔肝纤维化的诊断效能Table 3 Diagnostic efficiency of ARFI in the assessment of the stage of liver fibrosis in rabbitsFeatures

本研究结果显示，SWV、SWV1均可用于评估肝纤维化程度，SWV诊断肝纤维化分期≥F2期、≥F3期、F4期的AUC分别为0.901、0.939、0.945，截断值分别为2.21、2.29、2.36 m/s；SWV1诊断肝纤维化分期≥F2期、≥F3期、F4期的AUC分别为0.901、0.901、0.958，截断值分别为2.58、2.92、3.26 m/s。提示ARFI对兔肝纤维化具有较好的评价效能。本研究中肝纤维化分期F3期与F4期的SWV间无明显差异，与孙德胜等［18］的研究结果相似，提示肝纤维化分期之间的SWV存在重叠现象。

图4 SWV、SWV1诊断肝纤维化≥F2期的ROC曲线Figure 4 ROC curves of SWV and SWV1 for the diagnosis of ≥F2 stage liver fibrosis

图5 SWV、SWV1诊断肝纤维化≥F3期的ROC曲线Figure 5 ROC curves of SWV and SWV1 for the diagnosis of ≥F3 stage of liver fibrosis

图6 SWV、SWV1诊断肝纤维化F4期的ROC曲线Figure 6 ROC curves of SWV and SWV1 for the diagnosis of F 4 stage liver fibrosis

HORSTER等［19］研究显示皮肤到肝包膜的距离每增加1 cm，SWV下降0.132。本研究显示离体兔肝SWV1值较SWV高，提示其稳定性更好，这可能跟呼吸有关，因实验动物无法自主屏气，本课题组在进行活体兔SWV检测时，探头位于皮肤上，因此受呼吸影响较大，而离体检测时探头直接置于肝表面，不受呼吸影响，测量值相对更稳定。

目前ARFI技术已广泛应用于乳腺、甲状腺、肝脏等脏器肿瘤的定性诊断及化疗后的疗效监测，并取得了一定的效果。本研究结果显示新西兰大白兔ARFI SWV、SWV1均可用于评估肝纤维化程度。SWV、SWV1诊断兔各期肝纤维化程度的AUC均大于0.9。通常AUC越大，诊断的准确性越高，当其大于0.8时常被认为是具有较好诊断效能的标准，因此本研究结果表明SWV、SWV1具有较好的诊断兔肝纤维化程度的临床价值。

综上所述，ARFI技术可以用来评估兔肝纤维化程度，其诊断兔各期肝纤维化的AUC均大于0.9，具有较好的诊断效能。

作者贡献：李军进行文章的构思与设计，负责文章的质量控制及审校；童瑾、徐丽红、李军进行研究的实施与可行性分析；童瑾、曹春莉、马婷、刘闪闪、康燕飞、杜婷婷进行数据收集、整理；童瑾进行统计学处理，并撰写论文；童瑾、曹春莉进行结果的分析与解释；童瑾、李军进行论文的修订，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。