增生性瘢痕组织中肿瘤坏死因子αR1 mRNA的表达及意义

李勇铁 邹永红 刘德伍

【摘要】 目的：分析肿瘤坏死因子α受体1（TNF-αR1）在增生性瘢痕组织中基因表达情况，为今后从基因方面治疗增生性瘢痕提供依据。方法：选取48例增生性瘢痕组织患者为观察组（其中瘢痕组织增生时间1～3、4～6、7～12个月及1年以上各12例），12例正常瘢痕组织患者为对照组，以RT-PCR法对瘢痕组织中TNF-αR1 mRNA表达进行检测，比较各组TNF-αR1 mRNA水平差异。结果：对照组TNF-αR1 mRNA表达均高于观察组不同时间点TNF-αR1 mRNA表达，差异有统计学意义（P<0.05），且1年以上组织TNF-αR1 mRNA表达量均高于1～3、4～6、7～12个月组织（P<0.05）。结论：增生性瘢痕组织中TNF-αR1 mRNA表达低于正常瘢痕组织，同时随着时间增加增生性瘢痕中TNF-αR1 mRNA表达会显著上升。

【关键词】 瘢痕组织; 增生性; RT-PCR; 表达; 肿瘤坏死因子α受体1

【Abstract】 Objective：To analyze the gene expression of tumor necrosis factor α receptor 1（TNF-αR1）in hypertrophic scar tissue，and to provide evidence for gene therapy of hypertrophic scar in the future.Method：48 patients with hypertrophic scar tissue were selected as observation group（the scar proliferation time at 1-3，4-6，7-12 months and over 1year were occurred in 12 cases respectively）and 12 patients with normal scar tissue as control group.The expression of TNF-αR1 mRNA in scar tissue was detected by RT-PCR.The differences in TNF-αR1 mRNA levels among groups were compared.Result：The expression of TNF-αR1 mRNA in control group were higher than those of observation group at different time points（P<0.05），and the expression of TNF-αR1 mRNA in tissues over one year was higher than those of tissues over 1-3，4-6，7-12 months（P<0.05）.Conclusion：The expression of TNF-αR1 mRNA in hypertrophic scar tissue was lower than that of normal scar tissue，at the same time，the expression of TNF-αR1 mRNA in hypertrophic scar increased significantly with time.

【Key words】 Scar tissue; Hyperplastic; RT-PCR; Expression; Tumor necrosis factor α receptor 1

First-authors address：Jian Central Hospital，Jian 343000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.17.041

增生性瘢痕是臨床一种皮肤创面病理改变，为局部创面修复中组织过度增生形成，主要表现为颜色转变、痕突高低不平、质地实韧等，多发于真皮创伤，但也会出现于手术切口、较深的创伤[1]。目前增生性瘢痕治疗以手术为主，其只能起到缩小、改善的作用无法达到除去瘢痕效果，但随着人们对美观需求日益增加，如何有效治疗增生性瘢痕得到临床关注。近些年随着临床对增生性瘢痕研究深入，发现瘢痕过度形成中有多种细胞因子参与，而肿瘤坏死因子α（TNF-α）更在其中发挥重要作用，此因子由T淋巴细胞产生，参与自身免疫、炎症、休克等多种病理过程，不仅能杀伤肿瘤细胞，还能影响机体成纤维细胞分解、胶原合成[2-3]。而TNF-αR1作为TNF-α的受体1，其数目的多少，则将直接影响TNF-α的敏感性，即当TNF-αR1数目较多时，TNF-α就可更好地通过与TNF-αR1的结合而增加胶原酶和蛋白多糖酶的合成。Peruccio等[4]发现在增生性与正常瘢痕组织中TNF-α浸润细胞有明显差异，增生性组织阳性率低于正常组织，但其未就TNF-α基因动态表达、作用机制等进一步阐述。故本文通过观察正常及不同增生瘢痕组织中TNF-αR1基因表达情况，分析其在增生瘢痕形成、发展的意义，旨在为今后增生性瘢痕治疗提供依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取笔者所在医院2017年3月-2018年9月收治的增生性瘢痕组织患者48例为观察组，正常瘢痕组织患者12例为对照组。纳入标准：患者无言语、精神障碍;未合并恶性肿瘤、免疫性疾病;无外用瘢痕治疗药史;对照组组织颜色与正常皮肤相近，创面愈合时间3年以上。排除标准：患者临床资料不全，有长期免疫调节剂服用史;组织存在红肿、充血、溃烂情况。标本获取经患者知情同意、签署知情同意书，医院伦理委员会审核通过。

1.2 方法

1.2.1 仪器、试剂 分光光度仪（型号：Ultrospec3000，美国Pharmacia Biotech），TNF-αR1、β-actin引物由中山大学安达基因股份有限公司合成，PCR基因扩增检测仪（型号：ABI75000，北京欣兴强森生物科技有限公司），TD-2Y多功能离心机（中山市生科试剂仪器有限公司），RT-PCR试剂盒（中山大学达安基因有限公司），TRIzol Reagent总RNA提取试剂盒（美国英杰生命技术有限公司），凝胶成像分析系统（WD0413C型，北京）。

1.2.2 方法 （1）总RNA提取：将正常、增生性瘢痕组织，放入研钵加液氮冷冻，即刻研磨成粉末，研磨期间注意不断加液氮，然后室温放置2～3 min，将研磨组织移入离心管中，加TRIzol充分振荡，并静置5 min以使组织、细胞裂解充分，后行离心处理（12 000 g，10 min）去除沉淀。加氯仿抽提3 min，行高速离心处理（12 000 g，15 min，4 ℃），吸取上清液，加异丙醇沉淀RNA，再行高速离心（12 000 g，30 s，4 ℃），弃除滤液，重洗沉淀，并再次离心处理（12 000 g，130 s），稍微干燥后加无RNA酶水溶解，以获得总RNA。经电泳鉴定，所有样本D260/D280值在1.8以上，表明样品无明显蛋白污染，纯度较高，后调整总RNA浓度为0.5 mg/μL。（2）引物设计、PCR循环数：应用相关软件设计引物，设计上下游引物时为避免RNA中污染基因DNA扩增导致假阳性，需要将其设计在不同外显子上，本次以β-actin为内源性内参照。行定量PCR扩增，TNF-αR1 mRNA共28个循环，扩增产物为210 bp，β-actin mRNA共26个循环，扩增产物长540 bp。（3）PCR反应：每个标本取总RNA 2 mL，行RT-PCR反应，按试剂盒操作，取定量PCR反应产物行琼脂糖凝胶电泳，并以凝胶扫描成像分析仪行光密度扫描，以获取电泳条带的光密度，检测正常、增生性瘢痕组织中TNF-αR1 mRNA表达的变化，以目的基因mRNA与内参照β-actin mRNA比值表示。TNF-αR1引物上游：5CCATCTGCTGCACCAAGTGCCA-3;下游：5AATCCTGCGTGGCAGTTACACA-3。β-actin引物上游：5GTGGGGCGCCCCCAGCCA-3;下游：5CTCCTTATTGTCCACGATTTC-3。

1.3 观察指标 分析TNF-αR1 mRNA表达情况，比较不同增生时间组织中TNF-αR1 mRNA水平差异。

1.4 统计学处理 使用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较 观察组男10例、女38例，年龄19～48岁，平均（30.5±4.2）岁，组织增生时间：1～3个月12例、4～6个月12例、7～12个月12例、1年以上12例。对照组男3例、女9例，年龄20～49岁，平均（30.7±4.1）岁。两组性别、年龄资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 瘢痕组织TNF-αR1 mRNA表达 从增生瘢痕1～3、4～6、7～12个月及1年以上至正常瘢痕组织，值从左至右依次降低（TNF-αR1 mRNA表达量呈上升状态），见图1。

2.3 各组TNF-αR1 mRNA表达比较 观察组1～3、4～6、7～12个月及1年以上的TNF-αR1 mRNA相對表达量分别为（0.53±0.13）、（0.78±0.15）、（0.96±0.19）、（1.27±0.43），对照组TNF-αR1 mRNA相对表达量为（1.58±0.47），对照组TNF-αR1 mRNA表达均高于观察组不同时间点TNF-αR1 mRNA表达，差异有统计学意义（F=28.558，P=0.000），且1年以上组织TNF-αR1 mRNA表达量均高于1～3、4～6、7～12个月组织（F=20.739，P=0.000）。

3 讨论

人体受损皮肤通过新真皮、再上皮化形成来使创面愈合，其中新生真皮以肉芽组织填充为主，而肉芽组织为受损组织周围结缔组织（成纤维细胞、毛细血管、肌成纤维细胞等）生成[5]。临床发现在人体创面愈合过程中，不仅需要分子信号刺激相关细胞增殖，同时还要限制细胞增殖程度，避免过度修复造成不良影响，而一系列行为主要由程序性细胞凋亡控制[6]。而目前已知细胞凋亡除了受死亡受体Fas介导外，TNF-αR1也是一种可促细胞凋亡的死亡受体，临床认为其介导细胞凋亡在瘢痕形成过程发挥重要作用。同时已有研究证实抗TNF-α抗体阳性细胞所占比例在增生性瘢痕生长过程呈上升趋势，其提示TNF-α可能在增生性瘢痕发展中起重要作用，但与正常瘢痕比较，阳性细胞所占比例仍降低，推测可能与存在多种TNF抑制物、T淋巴细胞、巨噬细胞功能性降低有关[7-9]。

本次研究采用RT-PCR法对瘢痕组织中TNF-αR1 mRNA表达进行测定，结果显示，对照组TNF-αR1 mRNA表达均高于观察组不同时间点TNF-αR1 mRNA表达（P<0.05），且1年以上组织TNF-αR1mRNA表达量均高于1～3、4～6、7～12个月组织（P<0.05）。本次对TNF-αR1基因表达采用RT-PCR检测，其作为临床新型检测技术，自动化高、特异性强，能够将基因检测从定性转化为定量，准确度提高，同时本次计算TNF-αR1相对定量，能排除反应体系中可能出现的一切影响因素，较绝对定量的结果科学性、准确度高[10]。结果表明增生性瘢痕TNF-αR1基因转录水平低下，提示激活的T细胞及巨噬细胞功能低下，是组织TNF-α蛋白质水平降低的根本原因。且随着增生瘢痕逐渐成熟，组织中TNF-αR1基因转录水平也随之上升，表明在瘢痕成熟过程中激活的T细胞及巨噬细胞功能会有增强，临床认为这可能与糖皮质激素、肾上腺素等抑制T、巨噬功能物质水平降低及INF-γ等含量缓慢降低有关[11-12]。

有研究表明TNF-α可双向调节成纤维细胞，高浓度时可促纤维细胞处于增殖状态，而低浓度时能有效抑制细胞增殖，其双向调节机制可能与TNF-αR1作用成纤维细胞时介导的信号转导途径不同有关[13]。早期有学者认为低浓度TNF-α通过促聚胺多糖Ⅰ、Ⅲ型胶原合成来达到促成纤维细胞增殖的目的，但相关体外实验表明，TNF-α可促成纤维细胞增殖主要是通过直接诱导成纤维细胞增殖的信号转导而发挥作用[14]。文献[15]显示TNF-α可促人滑膜成纤维细胞增殖，来增加胶原酶合成，使胶原降解，而后期大量实验也证明了高浓度TNF-α能对成纤维细胞增殖产生抑制作用，还会减少细胞外基质合成，从而使组织中沉积减少，故而临床推测TNF-α在高浓度时，TRADD介导信号传递致细胞凋亡，从而达到抑制细胞增殖目的，同时由于细胞减少，使细胞外基质分泌、沉积减少，这有利于抑制增生性瘢痕形成[16-17]。本研究中增生性瘢痕随增生时间的增加，TNF-αR1含量逐步增加，临床认为当TNF-αR1含量处于低浓度时，会刺激机体内细胞增殖，从而使胶原酶合成增加，加速瘢痕主要成分胶原降解，使增生性瘢痕逐渐向正常瘢痕转变，故而TNF-αR1含量会增加[18]。因此笔者推测增生性瘢痕形成、发展可能与TNF-α基因逆转录水平降低有关，临床在抑制、治疗增生性瘢痕时可通过基因转染技术将TNF-αR1基因导入瘢痕成纤维细胞中，从而提高靶细胞敏感性，促发挥TNF-α发挥治疗作用，达到抑制增生性瘢痕形成的目的[19-20]。

综上，增生性瘢痕组织中TNF-αR1 mRNA表达低于正常瘢痕组织，同时随着时间增加增生性瘢痕中TNF-αR1 mRNA表達会显著上升。

参考文献

[1]刘达恩，黎洪棉，梁自乾，等.TNF-αR1 mRNA和Caspase-10 mRNA在增殖期增生性瘢痕组织中的表达及意义[J].广西医学，2010，32（1）：4-7.

[2]杨景山.医学细胞化学与细胞生物学技术[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1990：6-16.

[3]章建林，林子豪，江华，等.增生性瘢痕组织中肿瘤坏死因子αR1mRNA的表达及意义[J].中国临床康复，2004，8（17）：3296-3297，3438.

[4] Peruccio D，Castagnolic C，Stella M，et al.Altered biosynthesis of tumor necrosis factor（TNF）alpha is involved in postburn hypertrophic scars[J].Burns，1994，20（2）：118-121.

[5]章建林，林子豪，江华，等.增生性瘢痕组织中TNF-α mRNA的动态表达及临床意义[J].中华整形外科杂志，2004，20（1）：56-58.

[6]章建林，林子豪，江华，等.增生性瘢痕组织中TNF-α基因的表达及其意义[J].第二军医大学学报，2005，26（1）：48-50.

[7] Joyce D A，Steer J H，Abraham L J.Glucocorticoid modulation of human monocyte/macrophage function：control of TNF-alpha secretion[J].Inflamm Res，1997，46（11）：447-451.

[8]高春芳，徐玲玲，王皓，等.正常皮肤与瘢痕组织成纤维细胞对细胞因子、细胞外间质和胶原基因启动子反应性比较研究[J].中华皮肤科杂志，2003，36（11）：628-631.

[9] Duncan M R，Berman B.Differencial regulation of collagen，glycosaminoglycan，fibronection and collagenase activity production in cultured human adult dermal fibroblasts by interleukin1-α andβ and TNF-α and β[J].J Inest Dermatol，1989，92（5）：699-706.

[10]杜逸凤，潘宁，吴冬梅.病理性瘢痕与多种细胞因子相关性的研究进展[J].实用医院临床杂志，2016，13（1）：141-144.

[11]章建林，林子豪，江华，等.TNF-α及其受体TNF-αR1mRNA在增生性瘢痕组织中的表达及意义[J].中华物理医学与康复杂志，2004，26（5）：266-268.

[12]袁瑞红，刘流，赵德萍，等.TNF-α对瘢痕成纤维细胞影响的研究[J].广东医学，2010，31（5）：607-609.

[13]杨文玖，邹云雯，王志杰，等.肿瘤坏死因子-α对NIH3T3细胞成熟化作用的影响[J].齐鲁医学杂志，2010，25（3）：235-237.

[14]石光清，支科.β射线敷贴照射治疗增生性瘢痕机制及与肿瘤坏死因子-α关系研究进展[J].中国现代医学杂志，2010，20（10）：1546-1550.

[15] Zhang H G，Huang N，Liu D，et al.Gene therapy that inhibits nuclear translocation of nuclear fact or KB results in tumor necrosis factor α-induced apoptosis of human synovial fibroblasts[J].Arithritis Rheum，2000，43（5）：1094-1105.

[16]陈钊，李小静，王晖.构建肿瘤坏死因子α刺激基因6慢病毒表达及干扰载体及对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的影响[J].中国组织工程研究，2016，20（29）：4319-4327.

[17]田小雨，李小静，李心怡，等.TSG-6调控PI3K/Akt-Bcl-2通路影响人瘢痕疙瘩凋亡机制的研究[J].安徽医科大学学报，2018，53（4）：563-567.

[18]付晋凤，谭加.病理性瘢痕的发生机制与修复[J/OL].中华损伤与修复杂志（电子版），2013，8（4）：347-353.

[19]周俐，石光清，邱娟.β射线照射治疗增生性瘢痕患者血清肿瘤坏死因子的变化及意义[J].标记免疫分析与临床，2013，20（5）：315-318.

[20]李天石，曾文妮，何君君.甲壳素及其衍生物抑制瘢痕形成：研究与进展[J].中国组织工程研究，2014，18（52）：8504-8508.

（收稿日期：2018-10-29） （本文编辑：董悦）