体外法评估不同植物精油对需氧菌的抑菌活性

◆作者：张修坤 沈兆艳 吕勇 吴世林

◆单位：广州智特奇生物科技股份有限公司，广东广州510000

随着人们对抗生素使用造成病原菌产生耐药性、畜产品中药物残留超标以及动物机体自身免疫力下降等后果的关注，并且新出台的法律法规也明确规定了一些禁止在饲料中使用抗生素（毛红霞等，2011）。寻找有效、无耐药性、天然无污染、易生产的抗生素替代品已逐渐成为当今动物生产加工业的主要趋势（杨敏等，2017）。

植物精油（Essential Oil，EO）是植物体内的次生代谢物质，一般以植物的花、叶、枝、根、和果实等为原料，通过蒸汽蒸馏、压榨等方式方法萃取出的植物挥发性芳香物质（庄世宏，2002）。近年来大量的研究发现从香辛料等植物中提取的植物精油具有很好的抗真菌、细菌及其他微生物的活性（陈屹等，2008）。天然植物精油作为天然饲料防腐剂和胃肠道微生物的调控剂已成为目前的研发热点（朱晓磊等，2013）。

本研究根据相关的文献资料以及前期所做工作成果，选择含有抗菌活性的植物精油，包括肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油和丁香酚，测定其最低抗菌浓度，得到其天然植物精油与硫酸粘杆菌素的效价比，为实际生产应用提供理论依据。

1 试验材料

1.1 精油

市场上出售的不同厂家生产的肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油和丁香酚。

1.2 供试菌种

产肠毒大肠杆菌、出血性大肠杆菌、宋氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和乙型溶血性链球菌，均购买自广东省微生物研究所。

1.3 仪器

恒温恒湿箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-IG型单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；DHG-924OA电热恒温鼓风干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司；不锈钢手提式蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；FA2004电子天平（感量0.0001 g）：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；培养皿、试管、移液枪、接种环等。

2 方法

2.1 培养基的配制

将精油加入到5 mL不同菌株所对应的培养基中，充分混合，使各精油达到不同浓度梯度，每组三皿，待培养基凝固后，保存备用。

2.2 菌悬液的配制

从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种至相应的液体培养基中，放入恒温振荡培养箱培养至对数生长期，采用活菌计数法计数（管志远等，2005）。分别吸取以上培养时间的供试菌液0.5 mL，加入无菌水倍比稀释到 105～106cfu/mL，备用。

2.3 较强抑菌能力的精油的初选

将产肠毒大肠杆菌、宋氏志贺氏菌、乙型溶血性链球菌接种到不同梯度浓度的固体培养基上，用涂布棒涂布均匀，放置在38℃的培养箱培养 18～24h，无菌落长出的最低样品浓度即为MIC值（王改琴等，2014）。从中选出抑菌能力较强的精油进行复筛。

2.4 较强抑菌能力的精油的复选

将产肠毒大肠杆菌、出血性大肠杆菌、宋氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和乙型溶血性链球菌接种到对应的固体培养基上，用涂布棒涂不均匀，放置在38℃的培养箱培养 18～24 h，筛选出抑菌能力较强的精油。

3 试验结果

3.1 精油初筛试验结果

精油对需氧有害菌最低抑菌浓度如表1所示。对产肠毒大肠杆菌，抑菌能力由强到弱为：肉桂醛（0.02%）=百里香酚（0.02%）＞香芹酚（0.04%）＞牛至油（0.05%）＞丁香酚（0.07%）＞山苍子油（0.12%）；对宋氏志贺氏菌，抑菌能力由强到弱为：百里香酚（0.02%）＞香芹酚（0.04）=肉桂醛（0.04%）＞牛至油（0.09%）＞丁香酚（0.12%）＞山苍子油（0.14%）；对乙型溶血性链球菌，抑菌能力由强到弱为：牛至油（0.06%）＞百里香酚（0.07%）=香芹酚（0.07%）=丁香酚（0.07%）=牛至油（0.06%）＞肉桂醛（0.08%）＞山苍子油（0.13%）。由试验结果可知，肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油和丁香酚对本试验所选用供试菌株均有较好的抑制效果，因此选择该五种精油进一步试验。

表1 精油固态抑菌初筛试验结果（%）

3.2 精油固态抑菌复筛结果

根据初步筛选试验结果选择了肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油和丁香酚该五种精油进行复筛试验，实验结果如上表所示。由试验结果可知，肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油和丁香酚对本试验所选用供试菌株均有较好的抑制效果。对产肠毒大肠杆菌，抑菌能力由强到弱为：肉桂醛（0.02%）=百里香酚（0.02%）＞香芹酚（0.04%）＞牛至油（0.05%）＞丁香酚（0.07%）；对出血性肠炎大肠杆菌，抑菌能力由强到弱为：肉桂醛（0.02%）＞香芹酚（0.03%）＞百里香酚（0.04%）＞牛至油（0.05%）＞丁香酚（0.07%）；对宋氏志贺氏菌，抑菌能力由强到弱为：百里香酚（0.02%）＞香芹酚（0.04）=肉桂醛（0.04%）＞牛至油（0.09%）＞丁香酚（0.12%）；对痢疾志贺氏菌，抑菌能力由强到弱为：肉桂醛（0.04%）=香芹酚（0.04%）=百里香酚（0.04%）＞牛至油（0.05%）＞丁香酚（0.15%）；对猪霍乱沙门氏菌，抑菌能力由强到弱为：百里香酚（0.03%）=香芹酚（0.03%）＞肉桂醛（0.06%）＞牛至油（0.08%）＞丁香酚（0.15%）；对鼠伤寒沙门氏菌，抑菌能力由强到弱为：肉桂醛（0.04%）=百里香酚（0.04%）=香芹酚（0.04%）=牛至油（0.04%）＞丁香酚（0.18%）；对乙型溶血性链球菌，抑菌能力由强到弱为：牛至油（0.06%）＞百里香酚（0.07%）=香芹酚（0.07%）=丁香酚（0.07%）=牛至油（0.06%）＞肉桂醛（0.08%）。

在5种供试精油中，百里香酚对产肠毒大肠杆菌、宋氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、猪霍乱沙门氏菌、和鼠伤寒沙门氏菌的抑制能力较强，其最低抑菌浓度为0.02%～0.07%。肉桂醛对产肠毒大肠杆菌、出血性大肠杆菌、痢疾志贺氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌能力较强，其最低抑菌浓度为0.02%～0.08%。香芹酚对痢疾志贺氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果较好，最低抑菌浓度为0.03%～0.07%。牛至油对鼠伤寒沙门氏菌、乙型溶血性链球菌的抑制作用较好，其最低抑菌浓度为0.04%～0.09%。丁香酚抑菌能力弱于其他精油，其最低抑菌浓度为0.07%～0.18%。因此，固态培养条件下精油对需氧有害菌的抑制作用由强到弱为百里香酚＞肉桂醛＞香芹酚＞牛至油＞丁香酚。

表2 精油固态抑菌复筛试验结果（%）

4 讨论

植物精油的抑菌机理因活性成分的不同而有所差异，但通常认为其机理是精油中活性成分酚类、醇类物质进攻微生物的细胞膜或细胞壁，影响细胞膜脂质层的流动性，导致细胞膜通透性改变，细胞内容物外泄，最终引起细菌生长受到抑制甚至导致死亡。研究证明，电镜扫描结果发现用肉桂醛、牛至油等精油作用的有害微生物菌妊体形态出现扭曲、裂解、变扁和变细的现象，部分精油成分还会影响细胞膜结果，抑制相关酶活，干扰生物活性物质和核酸的合成，最终导致有害微生物生长受限甚至造成死亡（BURT等，2003）。此外，香芹酚可使枯草芽孢杆菌细胞膜中脂肪酸的比例和结构发生改变，从而降低其细胞膜的流动性。肉桂精油中的有效成分肉桂醛可与膜蛋白反应，造成蛋白质的凝结从而抑制产气肠杆菌的氨基酸代谢。丁香酚是通过使细胞膜中的蛋白质变性、与细胞膜上的磷脂发生反应，破坏膜的通透性，干扰蛋白质和细胞壁的合成，从而抑制微生物的生长。因此推测本试验所筛选的香芹酚、肉桂醛、丁香酚等植物精油通过以上作用方式，破坏大肠杆菌等有害微生物的菌体细胞结构，干扰其生物学功能的发挥而产生抑菌、杀菌的效果。

精油的抑菌活性与其成分的化学结构有关，一般醛类的抗菌活性最高，其次为酚。此外，醇类、醚类和烃类物质也具定的抑菌活性。而本试验结果证实不同精油对肠道有害菌的抑制作用由强到弱为百里香酚＞肉桂醛＞香芹酚＞牛至油＞丁香酚，与理论有差异，可能是由于精油的水溶性对抑菌效果影响所导致。

5 结论

综上所述，固态培养条件下，肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油和丁香酚对产肠毒大肠杆菌、出血性大肠杆菌、宋氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和乙型溶血性链球菌均有较好的抑菌效果，抑制作用由强到弱为百里香酚＞肉桂醛＞香芹酚＞牛至油＞丁香酚。肉桂醛、百里香酚、香芹酚、牛至油用于饲料中可以较好地杀灭有害菌，调整肠道微生物区系。

参考文献：（略）