肺炎链球菌融合蛋白疫苗研究进展

张素婷，黄 健,2，闵 迅,2※

(1.遵义医科大学检验医学院，贵州 遵义 563006； 2.遵义医科大学附属医院医学检验科，贵州 遵义 563003)

肺炎链球菌是一种革兰阳性兼性厌氧菌，其主要通过呼吸道飞沫与人直接接触传播，常以无症状的方式定居于健康人群的呼吸道，是一种机会致病菌。在免疫功能相对较差的人群(老年人、婴幼儿)及免疫缺陷人群中，肺炎链球菌可引起多种侵袭性疾病[1]，如社区获得性肺炎和脑膜炎等[2]。由于肺炎链球菌导致的疾病的严重性越来越受重视，故WHO建议各国进行常规的儿童肺炎链球菌疫苗接种[3]。目前，临床广泛使用的肺炎链球菌疫苗有23价肺炎链球菌多糖疫苗、7价肺炎链球菌结合疫苗。但其仅限于特定的血清型，且由于组分复杂而导致生产成本高。因此，以肺炎链球菌蛋白为免疫原的新型疫苗被提出[4]。目前，常作为肺炎链球菌蛋白质疫苗免疫原的有肺炎链球菌表面蛋白(pneumococcal surface protein，Psp)A、肺炎链球菌溶血素(pneumolysin，Ply)、肺炎链球菌表面黏附素A(pneumococcal surface adhesin A，PsaA)等。其中PspA的作用机制主要为抑制肺炎链球菌表面的补体沉积，从而减少吞噬作用[5-6]。Ply是一种胆固醇依赖性溶细胞素，是肺炎链球菌致病的重要因子，所以常用其减毒形式(Pds、ΔA146Ply等)作为肺炎链球菌疫苗组分[7-9]。PsaA是一种分子量为37 000的脂蛋白，在所有肺炎链球菌血清型中均具有遗传保守性，对调节肺炎链球菌黏附于细胞表面的能力至关重要[10-12]。此外，三联组氨酸蛋白D、黏附毒力因子A等其他毒力因子也作为免疫原在肺炎链球菌融合蛋白疫苗的研发中被使用[13]。现就肺炎链球菌融合蛋白疫苗的研究进展予以综述。

1 PspA相关融合蛋白质疫苗

1.1PspA家族融合蛋白 由于PspA结构具有多样性，所以基于PspA的疫苗应包含两个主要家族(1和2)的片段，每个家族至少一个，才能诱导针对更多血清型肺炎链球菌的保护[14]。有研究表明，使用含PspA家族1和2的融合部分(PspA1ABC-4B和PspA1ABC-3AB)片段的PspA融合蛋白，能诱导针对不同PspA片段肺炎链球菌的保护[15]。用 PspA 融合蛋白免疫的小鼠，能干扰产生不同PspA片段肺炎链球菌C3的沉积，而单独针对PspA家族1(PspA1ABC)和PspA家族2(PspA3ABC)片段所制备的单一蛋白质疫苗仅对其自身家族有效，所以PspA 融合蛋白疫苗可作为基于PspA抗肺炎链球菌感染的有效免疫策略[15]。Xin等[16]将来自肺炎链球菌菌株Rx1(家族1)和EF5668(家族2)的PspA组合形成PspA/Rx1-EF5668融合蛋白疫苗，发现该融合疫苗的免疫保护效果明显优于单一家族PspA。Piao等[17]进一步研究了不同PspA家族融合蛋白的效果证实，不同组合的融合蛋白免疫作用有差别，PspA3+2疫苗优于PspA2+4或PspA2+5疫苗。

1.2PspA-Pds Goulart等[18]将重组PspA-Pds融合蛋白接种到小鼠后发现，其可产生针对PspA和Pds的抗体，这些抗体能够结合表达同源PspA的肺炎链球菌，且结合能力与单独接种PspA蛋白质疫苗所产生的抗体相同，故针对融合蛋白的抗体，对携带异源PspA的细菌同样能产生特异性的抗体。 为提高PspA-Pds融合蛋白的免疫原性，有学者进一步构建了表达PspA-PdT的融合蛋白，在初免-加强策略中用PspA-PdT蛋白和肺炎链球菌重组表面蛋白A构建的肺炎链球菌重组表面蛋白A-PdT蛋白诱导高抗体反应，促进了IgG1/IgG2抗体同种型转变，增强了补体沉积到肺炎链球菌表面，从而保护小鼠免受致命攻击[19]。随后，他们又构建了两种新的表达SP0148和SP2108蛋白的重组卡介苗菌株，结果发现使用两种重组卡介苗菌株免疫小鼠后，可以诱导高水平的白细胞介素(interleukin，IL)-17A和γ干扰素产生。此外，Goulart等[20]将这些重组卡介苗菌株与重组卡介苗PspA-PdT(重组卡介苗 Mix)组合产生的融合蛋白联合使用发现可诱导更高水平的细胞免疫应答和体液免疫应答。因此，联合使用重组卡介苗菌株产生的融合蛋白可作为肺炎链球菌疫苗的初免-加强策略，以提高针对肺炎链球菌感染的保护力。

1.3PspA-PspC-产气荚膜梭菌肠毒素(clostridium perfringens enterotoxin,CPE) 如何将疫苗的有效成分传递至黏膜组织是黏膜疫苗在开发中必须考虑的问题。闭锁蛋白-4在鼻咽相关淋巴组织的上皮细胞中高表达，PspC-CPE的C端片段可以与闭锁蛋白-4结合，从而有效地将融合抗原传递给鼻咽相关淋巴组织和诱导抗原特异性免疫应答。Suzuki等[21]将PspC-CPE与PspA融合开发了一种鼻肺炎链球菌疫苗，PspA-PspC-CPE与闭锁蛋白-4结合可以有效附着于鼻咽相关淋巴组织，在用PspA-PspC-CPE鼻部免疫诱导的血清和支气管肺泡灌洗液中，他们发现了针对PspA特异性的IgG和IgA。这证明，PspA-PspC-CPE融合蛋白诱导机体产生的免疫反应能有效预防肺炎链球菌感染。

1.4PsaA-PspA 在评价PsaA-PspA融合蛋白对致死性感染保护效果的研究中，与鼻内感染肺炎链球菌后的牛血清蛋白对照组相比，PsaA-PspA融合蛋白免疫组小鼠血液和肺中的肺炎链球菌水平更低[22]。同时，该研究对融合蛋白PsaA-PspA23和单一PspA4疫苗进行对比发现，与单一PspA4疫苗对照组相比，PsaA-PspA23融合蛋白免疫组小鼠肺部肺炎链球菌菌株的清除率升高，血液中的细菌负荷降低，并显著提高了小鼠存活率(超过50%)。因此，研究者认为这种含融合蛋白的二价疫苗可能是荚膜多糖疫苗的良好替代品[23]。

1.5细菌样颗粒(bacterium-like particles，BLPs)/PspA-锚钩蛋白(protein anchor, PA) BLP传递系统的鼻内肺炎链球菌蛋白疫苗是将PspA(家族2 clade4)与PA融合，使BLPs表面表达PspA。研究显示，BLPs/PspA-PA鼻内免疫小鼠可以诱导其血清中产生针对PspA的特异性IgG，呼吸道灌洗液中产生特异性IgA[24]。因此，通过BLPs靶向递送细菌抗原可以通过诱导全身和黏膜免疫应答来预防肺炎链球菌感染。

Yu等[25]通过皮下注射融合蛋白PsaA-PspA23和单一蛋白质PspA4的混合物接种小鼠，同时使用PspA2-PA-BLPs和PspA4-PA-BLPs的混合物通过鼻内途径免疫另一批小鼠，建模完成后，用两种不同血清型肺炎链球菌攻击小鼠。结果发现经全身性疫苗和黏膜疫苗诱导后，针对PspA的IgG均显著增加，且黏膜疫苗能在小鼠黏膜中诱导特异性IgA的产生。由此证实，可以使用两种疫苗经不同途径实行共同免疫策略。

1.6PspA-多胺转运蛋白D Converso等[26]研究发现，PspA和多胺转运蛋白D组成的融合蛋白不仅能提供针对全身感染的保护，还能减少肺炎链球菌在鼻咽部的定植，这是单独使用PspA蛋白质疫苗皮下免疫所没有的效果。此外，该研究还探讨了PspA- 多胺转运蛋白D融合蛋白保护功效的潜在机制，揭示了该融合蛋白疫苗可增加不同血清型和遗传背景的肺炎链球菌菌株的结合能力、增强吞噬作用，并促进脾细胞分泌IL-17抗体的产生。

1.7特异性靶向人FcγRⅠ型(specifically targets human FcγR type Ⅰ，hFcRⅠ)-PspA Fc受体是细胞膜表面能与Ig Fc片段结合的受体。抗原靶向Fc受体可以在不存在佐剂的情况下增强对抗原的免疫应答，Bitsaktsis等[27]使用抗hFcRⅠ-PspA和重组PspA在不存在佐剂的情况下鼻内免疫野生型和hFcRⅠ转基因小鼠。结果显示，接受抗hFcRⅠ-PspA 的hFcRⅠ转基因小鼠血清和支气管肺泡灌洗液中的肺炎链球菌特异性IgA、IgG2c和IgG1抗体表达增加且血清补体C3水平明显升高。此外与用肺炎链球菌重组表面蛋白A免疫相比，用抗hFcRⅠ-PspA鼻内免疫的hFcRⅠ转基因小鼠产生了强烈的细胞和体液免疫应答，并增强了对致死性肺炎链球菌攻击的保护作用[27]。

1.8鞭毛蛋白(flagellin，Fla)B-PspA Fla可以依赖Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)5实现信号表达和转导，其可直接作用于巨噬细胞，上调小窝蛋白-1的敏感性。由于TLR5和窝小蛋白-1均在肺部、皮肤、肠道、脾脏中表达良好，故Lim等[28]将FlaB作为针对PspA的黏膜佐剂制备了融合蛋白。在青年和老年小鼠的肺炎感染模型中，FlaB-PspA融合蛋白诱导了更高水平的抗PspA特异性IgG和IgA应答，并对老年小鼠中肺炎链球菌的致死攻击具有高保护效力[28]。同时该实验表明，小窝蛋白-1/TLR5信号在年龄相关的先天性免疫反应中起关键作用，且针对TLR5的FlaB-PspA刺激可能是治疗老年人肺炎链球菌感染的有效策略。该课题组用FlaB-PspA融合蛋白经鼻内免疫小鼠发现，其不仅能诱导小鼠产生更高水平的特异性IgG和IgA，还能为肺炎链球菌的致死性攻击提供保护。此外，Nguyen等[29]研究发现FlaB-PspA还能诱导针对异源荚膜类型的交叉保护。上述研究表明，FlaB-PspA融合蛋白可作为肺炎链球菌黏膜疫苗或多价荚膜疫苗的有效伴侣蛋白。

1.9PspA-胆碱结合蛋白A(choline binding protein A，CbpA)-Ply 肺炎链球菌CbpA在肺炎链球菌的感染过程中有一定的致病作用。Chen等[30]使用不同的小鼠模型来测试各种多价蛋白质疫苗的功效，这些疫苗包含免疫原Ply、CbpA或PspA的全长或肽区域的各种组合：具有L460D替代的Ply类毒素(在此简称L460D)与CbpA的保护性肽表位融合；L460D与含有PspA富含脯氨酸区的CD2肽融合；L460D和H70(L460D+H70)的组合；H70+YLN和其他组合。经腹膜内或皮下使用各种抗原组合的3个剂量(间隔2周)免疫小鼠，然后用不同种血清型肺炎链球菌通过不同的感染途径攻击小鼠。在腹腔感染脓毒症模型中，H70+YLN始终能抵抗1、2、6A型菌株的致死性感染，而CD2+YLN和L460D+H70的组合也能在致死性感染中提供有效保护； PspA 衍生的抗原组分在静脉内败血症(3型和6A型攻击菌株)模型中表现出良好的保护作用，且H70在有或没有L460D或YLN的情况下均能诱导较好的免疫反应。因此，H70+YLN的三价抗原组合在多种肺炎链球菌攻击模型中均表现出良好的保护效果。

2 PsaA相关融合蛋白质疫苗

2.2霍乱毒素B亚基(cholera toxin B subunit，CTB)-PsaA CTB负责霍乱全毒素与细胞的结合，是一种疫苗的黏膜佐剂。Pimenta等[34]发现，使用CTB-PsaA融合蛋白进行鼻内免疫能保护小鼠免于肺炎链球菌在鼻咽部的定植，且不会改变小鼠口腔和鼻咽的正常微生物群。Arêas等[35]将CTB基因与PsaA基因进行融合，并将纯化的重组CTB-PsaA融合蛋白用于BALB/c小鼠的鼻内免疫实验。结果显示，CTB-PsaA能够诱导小鼠血清、唾液、鼻黏膜及支气管洗涤液中肺炎链球菌抗体的表达，表明CTB-PsaA 可作为肺炎链球菌候选蛋白疫苗进行研究。在随后的研究中，他们将CTB-PsaA融合蛋白通过腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠，然后将小鼠暴露于肺炎链球菌中，结果发现与其他组相比，免疫组小鼠虽然生存时间并没有延长，但其血清中却产生了大量IgG抗体[36]。

2.3PsaA-IL-2和PsaA-IL-4 用完全弗氏佐剂乳化的PsaA免疫小鼠，可以提供针对肺炎链球菌致死性感染的保护。但完全弗氏佐剂的使用在人类中不被接受，所以研究者们需寻求其替代方法。有学者将PsaA的编码序列与编码小鼠IL-2、IL-4或源自小鼠IL-1β的基因序列进行连接，构建了PsaA-细胞因子融合蛋白并在大肠埃希菌中进行表达[37]。结果显示，用PsaA-IL-2或PsaA-IL-4免疫小鼠产生的PsaA特异性抗体的滴度与使用完全弗氏佐剂时相当。另外，由于PsaA-Adj(Adj是一种不完全弗式佐剂)诱导产生的抗体主要为IgG1亚类，而PsaA-IL-2和PsaA-IL-4除IgG1外还诱导小鼠表达大量的IgG2a，所以PsaA-Adj或PsaA-IL-4均显示出对肺炎链球菌腹膜内攻击的保护作用[37]。在无佐剂的情况下，用PsaA免疫和PsaA-IL-2免疫的小鼠在受到攻击后的存活率分别为0%(0/20)和5%(1/20)[37]。这说明PsaA与IL-2或IL-4的组合，单独或与合适的黏膜佐剂联合，可作为肺炎链球菌的候选疫苗。

2.4PsaA-肺炎链球菌胆固醇结合蛋白A(streptococcus pneumoniae cholesterol binding protein A，PcpA) PcpA可能在肺炎链球菌的黏附过程中起作用。赵博[38]构建了PsaA-PcpA融合蛋白，并用其免疫小鼠，检测特异性抗体水平，同时用不同血清型的肺炎链球菌对免疫后的小鼠进行攻毒，检测肺组织及鼻腔中的细菌定植量。结果发现，PsaA-PcpA融合蛋白能够有效刺激小鼠产生免疫应答，血清抗体效价在1×105以上，而呼吸道中细菌定植量显著下降。这表明，PsaA-PcpA融合蛋白不仅能减少肺炎链球菌对宿主细胞的黏附，还能刺激机体产生高效价的抗体，从而起到较好的保护作用。

3 其他融合蛋白质疫苗

Ply的减毒形式ΔA146Ply具有较好的黏膜佐剂功能，其与DnaJ融合表达后通过黏膜免疫可以诱导C57BL/6小鼠产生较高水平的特异性IgG和sIgA，可帮助小鼠有效抵抗肺炎链球菌在鼻咽部、肺部的定植和致死性感染，保护效果与市售23价肺炎链球菌多糖疫苗相当，且具有非血清型依赖性[39]。Su等[40]发现，与单独给予DnaJ相比，用融合蛋白DnaJ-ΔA146Ply经皮下免疫的小鼠产生的抗DnaJ IgG滴度更高，且可以诱导针对定植和致死性肺炎链球菌感染的B细胞和T细胞依赖性保护，能明显提高小鼠血清中的γ干扰素、IL-4和IL-17A水平[40]。此外，Wang等[41]证实用DnaJ-ΔA146Ply融合蛋白皮下免疫的TLR2-/-小鼠，在用肺炎链球菌菌株D39或19F攻击后显示出较野生型小鼠更低的存活率和更高的细菌定植；且在TLR2-/-小鼠脾细胞中，γ干扰素水平降低。该研究结果表明，TLR2的表达对于用DnaJ-ΔA146Ply免疫的小鼠能有效诱导产生辅助性T细胞1的免疫应答。同时也有研究表明，DnaJ-ΔA146Ply融合蛋白可通过蛋白激酶B和核因子κB信号通路刺激巨噬细胞诱导免疫应答[42]。

另有研究者将衍生自CbpA的生物活性肽与Ply类毒素L460D进行融合，并在鼻咽炎、中耳炎、肺炎、败血症和脑膜炎小鼠模型中测试融蛋白质疫苗的功效[43]。结果证实，与单独的肺炎链球菌疫苗相比，CbpA-L460D肺炎链球菌融合蛋白具有更广泛的免疫原性，且抗体在体外对肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌和流感嗜血杆菌均有活性。此外，该融合蛋白疫苗可在被动免疫和主动免疫途径中保护小鼠免于肺炎链球菌感染。

除上述较为广谱的融合蛋白疫苗外，还有研究者设计了肺炎链球菌菌毛蛋白亚基RrgB的三种变体组成的RrgB321融合蛋白，由于肺炎链球菌菌毛1存在于30%～50%的侵袭性致病菌株中，所以由RrgB321组成的疫苗可能覆盖30%或更多血清型的肺炎链球菌菌株[44-45]。

4 小 结

PspA作为在各型肺炎链球菌中广泛表达且免疫原性最强的免疫原被广泛应用于融合蛋白疫苗中。目前，肺炎链球菌融合蛋白的研发主要有两种思路：①将不同免疫原位点融合，以达到覆盖更多菌株的目的；②将抗原位点与疫苗佐剂蛋白融合，以达到放大免疫反应或将疫苗有效成分更好运送到菌株定植部位的目的。在今后的融合蛋白研发中，将两种思路结合可以取得更大进展。此外，肺炎链球菌融合蛋白疫苗研究主要处于临床前研究阶段，研究对象主要为小鼠，未来期待更多的临床研究数据和成果。