玉米芯木聚糖硫酸酯的合成、表征及其抗凝血活性

樊洪玉, 卫 民,2*, 赵 剑, 蒋剑春

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室， 江苏 南京 210042； 2.中国林业科学研究院 林业新技术研究所， 北京 100091)

半纤维素是重要的天然多糖，由于其具有良好的生物相容性、生物降解性和无毒性等特性，已广泛应用于食品和非食品领域。玉米芯中的半纤维素含量较高，半纤维素的结构为聚木糖型。大多数的研究通常使用玉米芯为原料，采用生物化学法来提取木聚糖，但所得的木聚糖相对分子质量较小、聚合度在2～3之间，为低聚木糖，主要作为功能性保健品[1-3]。近年来，利用玉米芯半纤维素木聚糖的生物特性来研发高附加值的化学品和医药产品得到了广泛的关注[4-6]。临床上常使用的抗凝血剂和抗血栓剂为肝素钠，但是在使用的过程中通常存在出血和血小板减少症的副作用[7]。有研究表明，硫酸根离子与多糖结合而成的硫酸化多糖具有优异的血液相容性和抗凝血活性。因此，具有无健康风险的新的抗凝血和抗血栓特性的硫酸化多糖成为新的研究热点[8-10]。Liang等[11]使用南瓜多糖为原料合成了硫酸化衍生物，该衍生物在较高的取代度(DS)时，可以获得较强的抗凝活性。Kamitakahara等[12]合成的新型硫酸化多糖不仅具有抗凝血活性，还对黑色素瘤肺转移有抑制作用。天然木聚糖通常是具有不同结构和生理活性的大分子的混合物，将硫酸基团引入天然多糖是获得具有生物学性质的抗凝血剂的有效方式。但是多糖在提取制备过程中结构不稳定，并且在硫酸化改性的过程中，尤其是在强酸性条件下容易降解，反应条件难于控制，制备的硫酸化多糖相对分子质量分散系数大，分布较宽，是一个混合体，其抗凝机理和潜在功效仍在不断探索中。因此需寻找一种适用于所用多糖原料的反应条件温和可控，且产物性能稳定的硫酸酯化改性方法。由于木聚糖不溶于水及大部分溶剂，而在加热的条件下可溶于非质子溶剂DMF、DMSO、FA等。因此，本研究以玉米芯木聚糖为原料，在不同的非质子溶剂中，通过三氧化硫-吡啶法合成了木聚糖硫酸酯，采用正交试验对合成工艺进行了优化，并对其结构和性能进行了表征，进一步测定了其体外抗凝血活性，以期为木聚糖硫酸酯作为新型抗凝血剂的应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

玉米芯取自山东省聊城市，经自然风干后，选择无霉变、无虫蛀的玉米芯，破碎，过0.25 mm孔径筛。将得到的玉米芯粉末用质量分数为95%的乙醇溶液在索氏提取器中抽提12 h，脱除蜡质。用去离子水洗涤，真空干燥，置于干燥器中备用。原料的主要化学组成可参照美国国家可再生能源实验室标准(NREL/TP-510- 42618)测定，测得所用原料含纤维素39.03%、半纤维素33.18%、木质素14.23%。

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺(FA)均为分析纯，并在使用前用5Å分子筛处理除去水。活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)试剂盒，上海太阳生物技术有限公司。肝素钠(MW为6 000～20 000 u)，上海博奥生物技术有限公司。三氧化硫吡啶络合物，国药集团化学试剂有限公司。新鲜血液从江苏省血液中心收集。其他试剂均为市售分析纯。

CN61M308113凝胶色谱仪，北京中西化玻仪器有限公司；Thermo Fisher Nicolet IS 10型傅里叶变换红外光谱(FT-IR)仪，美国Thermo公司；Elemental Vario MICRO元素分析仪，德国Elementar公司；Bruker WNMR-I-500 MHz型核磁共振波谱仪，德国Bruker公司。

1.2 玉米芯木聚糖的分离制备

取脱蜡后的玉米芯20 g，按照固液比1 ∶25(g ∶mL，下同)加入去离子水，75 ℃抽提3 h。固液分离，向滤渣中按照固液比1 ∶20加入碱性过氧化氢溶液(1% H2O2、 5% NaOH)，50 ℃处理16 h。减压过滤，用盐酸中和至中性，减压浓缩至250 mL，向所得的液体中加入1 L的质量分数为75%的乙醇，离心分离(8 000 r/min，15 min)，洗涤固体沉淀、去离子水透析、冷冻干燥后得到木聚糖产品，于4 ℃冰箱内保存备用。

提纯后的玉米芯木聚糖主要化学组成参照NREL/TP-510- 42618测定，其中木聚糖73.5%、阿拉伯聚糖14.7%、半乳聚糖5.9%和葡聚糖5.8%(以干质量计)。

1.3 木聚糖硫酸酯的合成

玉米芯木聚糖是由D-吡喃型木糖单元通过β-1,4-糖苷键连接而成的，在一定条件下D-木糖单元C-2和C-3键上的羟基可以与三氧化硫吡啶络合物(SO3·Py)发生酯化反应，合成玉米芯木聚糖硫酸酯，反应原理如图1所示[13]。将2 g LiCl固体加入到20 mL的非质子溶剂(DMF、DMSO或FA)中，加热搅拌至LiCl固体完全溶解。冷却至室温后，再加入1.8 g木聚糖，加热溶解。冷却至室温，加入三氧化硫吡啶络合物，在给定的温度和时间下反应。反应结束后，冰浴冷却至室温，用质量分数5%NaOH溶液中和，加入一定量的无水乙醇，静置。离心分离，得到木聚糖硫酸酯粗产品。然后，将木聚糖硫酸酯粗产品在截留相对分子质量为3 500的透析袋中用去离子水透析4天(每隔8 h更换一次水)，除去无机盐和一些小分子的降解产物。最后将溶液冷冻干燥，得到木聚糖硫酸酯产品。

图1 木聚糖硫酸酯的合成过程Fig.1 The schematic diagram for the synthesis of xylan sulfate

1.4 分析与表征

1.4.1 硫酸基取代度的测定 采用氯化钡-明胶法测定硫酸基的质量分数[14-15]。取代度(DS)可根据硫元素质量分数(w)来计算，公式如下：

DS=(132×w)/(32-102×w)

式中： 132—玉米芯木聚糖分子中木糖单元的相对分子质量； 102—木聚糖分子中1个羟基被取代后变为—OSO3Na时，相对分子质量的增加值； 32—S的相对原子质量；w—样品中硫元素的质量分数。

1.4.2 凝胶渗透色谱分析 通过凝胶渗透色谱(GPC)来测定木聚糖硫酸酯的相对分子质量。检测所用色谱柱型号为Waters styrage HT6，柱温箱温度为25 ℃，检测器为SFD RI-2000示差折光检测器，流动相为0.001 mol/L NaCl溶液，流速为1 mL/min，标准品为聚乙二醇，进样量为20 μL，进样质量浓度0.2 g/L，在进样分析前通过0.25 μm微孔滤膜过滤样品。

1.4.3 红外光谱分析 通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)仪对合成的木聚糖硫酸酯样品进行红外光谱分析，仪器的分辨率优于4 cm-1，样品的扫描次数为16次/s，扫描波数范围为525～4000 cm-1。

1.4.4 元素分析 采用元素分析仪对玉米芯木聚糖和木聚糖硫酸酯进行元素分析，主要测定C、H、O、S这4种元素的含量。

1.4.5 核磁共振分析 木聚糖硫酸酯的13C NMR使用核磁共振波谱仪进行分析，以D2O为溶剂。其中13C NMR 谱的扫描数为10 000，脉冲宽度为11.5 μs，延迟时间为2 s。

1.5 木聚糖硫酸酯的体外抗凝血活性测定

将健康的新鲜血液与3.8%柠檬酸钠溶液按照体积比9 ∶1混合，4 ℃下离心沉淀(8 000 r/min，20 min)，收集上层清液，即为贫血小板血浆(PPP)，并于-20 ℃的冰箱内储存备用。在进行抗凝血活性分析时，37 ℃恒温融化，3 h内使用。

使用APTT、PT和TT来表示木聚糖硫酸酯的抗凝血活性，并以商业普通肝素钠做对比。首先，将木聚糖硫酸酯配制成不同质量浓度的溶液。在37 ℃恒温条件下，加入PPP，使之充分混合后，再分别加入APTT、PT和TT测定试剂。在37 ℃恒温5 min后，加入已经预热的CaCl2溶液，并且在自动凝血计上记录凝血时间。

2 结果与讨论

2.1 木聚糖硫酸酯的合成条件优化

硫酸盐基团在多糖的抗凝血活性中起着重要作用，多糖的硫酸基取代度(DS)是生物活性的重要参数。本试验以硫酸基的取代度(DS)为指标，以反应温度(A)、时间(B)、SO3·Py与木糖单元羟基的物质的量之比(C)和反应溶剂(D)为因素，设计4因素3水平正交试验L9(34)，对合成工艺进行优化，从而获得高取代度的木聚糖硫酸酯。木聚糖硫酸酯合成工艺的正交试验设计及结果分析如表1所示。由表1极差分析可知，各因素对取代度影响的顺序依次为C>D>A>B，即SO3·Py与木糖单元羟基的物质的量之比是影响木聚糖硫酸酯取代度的最显著因素；最佳水平为A2B2C2D1，即以DMF为溶剂，反应温度为55 ℃，时间为3 h，SO3·Py与木糖单元羟基的物质的量之比为1.5 ∶1。经验证实验得到该条件下硫酸基取代度为1.53。以最佳条件下合成的木聚糖硫酸酯进行后续的结构表征。

表1 木聚糖硫酸酯合成工艺的正交试验设计及结果分析

为验证正交试验的结果，在DMF溶剂中，SO3·Py与木糖单元羟基的物质的量之比为1.5 ∶1条件下，考察了反应时间、反应温度对取代度和木聚糖硫酸酯得率的影响，结果见图2。

图2 反应时间和温度对硫酸基取代度DS(a)和得率(b)的影响Fig.2 Effect of reaction time and temperature on the DS(a) and yield(b) of sulfate group

由图2(a)可知，反应温度为55 ℃时，硫酸基的取代度(DS)在0～3 h内随着硫酸化时间的延长而迅速增加，在3 h时达到最大值1.53，随着反应时间的继续延长，DS不再增加，反而略有下降。45 ℃也有相似的规律，但是45 ℃条件下测得的DS相对较小。因此，反应时间以3 h为宜。

由图2(b)可知，反应温度为55 ℃时，木聚糖硫酸酯的得率在最初反应的1 h内随着反应时间的延长而迅速增加，1 h的得率为68.2%，3 h的得率达到最大值78.2%，但继续延长反应时间，木聚糖硫酸酯的得率有所减小。木聚糖为易降解多糖，在酸性条件下非常容易发生降解，另外随着反应时间的延长，也导致产物颜色加深，故选择反应时间为3 h。在4 h之前，45 ℃条件下木聚糖硫酸酯的得率均小于55 ℃的得率；但是随着反应时间的延长，当反应5 h时45 ℃的得率高于55℃，这是因为温度越高，木聚糖越容易降解，致使得率降低。

2.2 玉米芯木聚糖硫酸酯的结构表征

2.2.1 GPC分析 硫酸多糖的相对分子质量是影响生物活性的另一个重要参数。GPC分析发现，玉米芯木聚糖(图3(a))和木聚糖硫酸酯(图3(b))均呈现单一中心峰，表明它们近似于均聚体结构，组成更加均一。玉米芯木聚糖的数均相对分子质量为45 394、重均相对分子质量为65 433、多分散系数为1.441，小于1.5，为结构均一型的聚合多糖。木聚糖硫酸酯的数均相对分子质量为30 852、重均相对分子质量为36 754、多分散系数为1.191，小于1.5，为结构均一型的多糖硫酸酯。韩亮等[16]以玉米芯木聚糖为原料，采用氯磺酸-吡啶法对木聚糖进行硫酸化改性，得到木聚糖硫酸酯的多分散系数大于1.5。所制备的木聚糖硫酸酯结构不如本研究制备的多糖硫酸酯均一。此外，本研究得到的木聚糖硫酸酯的分子质量小于玉米芯木聚糖的分子质量，说明木聚糖的硫酸化过程中木聚糖分子链发生了断裂。因此，如何控制木聚糖硫酸酯的相对分子质量是今后研究的关键。

图3 玉米芯木聚糖(a)和木聚糖硫酸酯(b)的GPC分析Fig.3 GPC analyses of corn cob xylan(a) and xylan sulfate(b)

图4 木聚糖(a)和木聚糖硫酸酯(b)的FT-IR图 Fig.4 FT-IR spectra of the xylan(a) and xylan sulfate(b)

表2 玉米芯木聚糖和木聚糖硫酸酯的元素分析

2.2.3 元素分析 玉米芯木聚糖和木聚糖硫酸酯的C、H、O、S这4种元素的含量如表2所示。由表2可知，经硫酸化改性后，木聚糖硫酸酯中S含量增加的同时，H含量降低，说明硫酸根取代了木聚糖上的氢，由于S元素的增加，导致C元素所占比例有所下降，与2.2.2节红外光谱分析结果相吻合。

2.2.413C NMR分析 对玉米芯木聚糖和玉米芯木聚糖硫酸酯进行了13C NMR分析，结果见图5。由图5(a)可知，玉米芯木聚糖的13C NMR谱中有δ101.90(C-1)、δ74.10(C- 4)、δ77.70(C-3)、δ76.04(C-2)和δ61.10(C-5)5个主要信号峰，为(1→ 4)-β-D-吡喃木聚糖。由图5(b)可知，经硫酸化改性后，13C NMR谱中C-1、 C-2、 C-3、 C- 4、 C-5的δ值分别变为105.06、 75.10、 75.26、 78.58、 65.99。C-2和C-3向高场的方向偏移，表明C-2、C-3与呈电负性的硫酸酯基团直接相连。由于C-2和C-3的硫酸化作用，C-1、C- 4和C-5转移到较低场[21-22]。

图 5 玉米芯木聚糖(a)和木聚糖硫酸酯(b)的13C NMR图Fig.5 13C NMR spectra of the corncob xylan(a) and xylan sulfate(b)

2.3 体外抗凝血活性分析

酸化多糖的体外抗凝血活性采用经典的APTT、PT和TT凝血分析评估测定，其中APTT主要用于分析评估内源性凝血途径，即在Ca2+存在下加入促凝血酶原激酶后形成凝块所需的时间[23-24]，TT主要测定加入血浆后生成的凝血酸使纤维蛋白原转化为纤维蛋白的时间[13]，PT为凝血酶原时间，是血检前状态，DIC及肝病诊断的重要指标，作为外源性凝血系统的过筛试验，也是临床口服抗凝治疗剂量控制的重要手段，主要用于评估外在途径。

以所制备的玉米芯木聚糖为原料，当反应温度为55 ℃、三氧化硫-吡啶络合物与木糖单元羟基物质的量之比为1.5 ∶1时，硫酸酯化反应时间为1、2和3 h时，分别合成木聚糖硫酸酯XS-1、XS-2和XS-3，配制成不同质量浓度的溶液进行体外抗凝血活性测定，并与商业肝素钠进行比较，结果见表3。

由表3可以看出，与未加入任何凝血剂的空白对照组相比，加入木聚糖硫酸酯后APTT和TT均延长，但对PT的影响相对较小，这表明木聚糖硫酸酯具有抗凝血活性，可能是通过影响APTT和TT来发挥抗凝血作用的。同时，木聚糖硫酸酯的抗凝血活性随着取代度和质量浓度的增加而增加，高相对分子质量、低取代度的木聚糖硫酸酯通过增加样品质量浓度，可以达到与低相对分子质量、高取代度的木聚糖硫酸酯相当的抗凝血效果。从表3可以看出，阳性对照组肝素钠能够显著延长APTT，而木聚糖硫酸酯的抗凝血活性比肝素钠弱，但是在较高质量浓度的条件下XS-3可以达到与肝素钠相近的抗凝血效果，这为木聚糖硫酸酯代替肝素钠成为抗凝血剂提供了可能。由于木聚糖硫酸酯的结构与抗凝血性能之间存在复杂的关系，特别是不同取代度与相对分子质量的相关性。因此，今后将重点研究木聚糖硫酸酯结构与其功能的关系。

表3 木聚糖硫酸酯对APTT、PT和TT的影响

3 结 论

3.2 通过体外抗凝血活性测试发现，木聚糖硫酸酯可以延长APTT和TT，且抗凝血活性随着取代度和质量浓度的增加而增加，是一种有效的抗凝性物质；同时，高取代度和高质量浓度的木聚糖硫酸酯的抗凝血效果与阳性对照肝素钠相近，表明木聚糖硫酸酯具有新型抗凝血剂的应用前景。