无需使用离心机即可快速收获细胞

文/J.Stephenson，C.Bladen

可一步完成抗体澄清和除菌过滤 // 单克隆抗体被具有极其广泛的应用，无论是用于基础研究还是生物制药。时至今日，收获哺乳动物细胞培养液依然是项耗时的工作，尤其是在实验室规模不大，并且还要涉及离心过程。但如今，采用新式硅藻土过滤解决方案可显著改善并加快该过程。

单克隆抗体（mAb）被广泛地应用在生物药开发、基础研究和体外诊断上。单克隆抗体的表达系统通常利用信号肽来确保抗体分泌到细胞培养基中。虽然该方法可降低纯化操作的复杂程度，避免细胞破碎，却需要使用各种成本昂贵、费时费力的技术来将细胞与含有抗体的培养液分离。方法通常涉及生产哺乳动物细胞抗体，无论是使用杂交瘤的标准生产，还是使用中国仓鼠卵巢细胞（CHO）或人胚肾细胞系（HEK）的重组生产 ，使用的生物反应器规模一般大于50 L，采用连续离心和深层过滤等工艺进行操作。

然而，在研究开发上，通常每种抗体仅需要不到10 L的细胞培养液，因此这些过程不仅成本昂贵，而且不切合实际。所以在研究开发上使用最广泛的方法是先使用离心机进行澄清操作，接着使用手动注射器或真空瓶口过滤器将上清液分别注入0.20、0.22或0.45μm 过滤器中进行过滤。该方法经济实惠，易于操作，可与大多数实验室中的标准设备配合使用。但是，这些过滤器并非采用深层设计，因此悬浮液中残留的亚微颗粒易于堵塞过滤器。作为一家专注于抗体表达、测序和工程的公司，Absolute Antibody则使用HEK293和CHO-K1细胞实现重组抗体瞬时表达。

该公司的实验室每周通常可制备50种抗体，规模从30 mL到20 L，每周总产量约为100 L细胞。在过去的6年中，实验室专家一直使用离心后再用瓶口过滤装置过滤的方法来制备所有抗体。随着Absolute Antibody产量的提升，对离心机数量的需求也随之增加。在此期间，实验室工程师研究了众多替代方案，包括使用专为室内酿造和絮凝剂（例如几丁聚糖）而设计的过滤器。这些方法都被证明效率低下，不能满足实验需求。

为降低澄清哺乳动物细胞培养液所用的时间和工作量，赛多利斯集团专门研制出了一款Sartoclear Dynamics Lab V 过滤系统。向培养液中添加硅藻土（DE）有助于多孔滤饼成型防止堵塞过滤器，并快速移除样本中的细胞和细胞碎片，见图1。因此，该过程中无需离心操作，避免了离心机容量和可用性方面的问题，同时还防止了过滤器堵塞。接着，测试Sartoclear Dynamics Lab V过滤系统，并与公司的标准过程进行比较。

材料和方法

悬浮的HEK293或CHO细胞在无血清培养基中生长，并使用可编码单克隆抗体的重轻链的DNA质粒转染。经过6到14天转染后，进行纯化操作，可收获细胞。对于1 L的规模为例，首先在台式离心机中按照3.500 kg的重量要求，进行离心操作45 min，并使用1个或多个真空 PES 0.45μm瓶口过滤器进行过滤。将过滤后的上清液加载至具有5 ml蛋白A柱的ÄKTA蛋白纯化仪中，以捕获抗体，并在低pH缓冲液中洗脱。随后，中和抗体，并进行其他纯化操作（例如，阳离子交换剂或尺寸排阻色谱法）或者直接按照特定批次抗体的要求进行质量控制。

质量控制手段包括：非还原和还原性SDS-PAGE、SEC-HPLC、内毒素检测，必要时可使用ELISA测量结合活性，见图2。

在改进的下游工艺中，可使用Sartoclear Dynamics Lab V代替离心和过滤操作。如果是1 L的细胞培养液，可向其中添加20 g的DE。充分混合细胞和DE后，直接将其添加至 Sartoclear Dynamics Lab包装中附带的1000 mL PES 0.22 μm Sartolab RF真空过滤器中。施加真空，并将澄清的细胞培养液收集在1 L的瓶中。按照上述的纯化和质控过程对滤液进行处理。

图1 使用常规过滤和Sartoclear Dynamics Lab过滤方法澄清细胞培养液的原理。

图2 Absolute Antibody公司生产重组抗体的下游处理工作流程。

结果与讨论

为了将Sartoclear Dynamics Lab V与标准工艺进行对比，可使用HEK293细胞制备2 L的人源化抗EGFR IGG1抗体（西妥昔单抗：Absolute Antibody 产品目录编号Ab00279-10.0）。经过6天的转染后，将培养液平均分成两份。细胞收获时，细胞密度为2.4×106cells/mL，存活率为65%。

使用常规工艺方法对其中1L细胞培养液进行处理，包括45 min的离心操作，接着使用三个0.45μm PES 500 mL瓶口过滤器进行过滤。这些过滤器通常在过滤了400 mL上清液后出现堵塞，意味着每升细胞培养液平均需要三个过滤器。该过程中并未使用孔径大小为0.22μm的过滤器，以便在发生堵塞前提高上清液的过滤容量。过滤1L细胞需要9 min，其中包括48 s的手动操作时间，因此将整体工艺时间延长至约55min。

使用Sartoclear Dynamics Lab V处理另外1 L细胞培养液。将两袋10 g的DE加入细胞中，然后充分混合。将细胞倒入1000 mL 0.22μm Sartolab RF过滤器中并施加真空。整个过滤过程中并未出现堵塞，从添加DE到完成过滤，总计耗时8 min27 s。这表明该方法大约只需传统方法处理时间的15%，如图3所示。

图3 根据处理时间对比澄清操作。

为了确认Sartoclear Dynamics Lab V工艺对抗体质量无影响，分别使用两个样本进行纯化和质量控制。最后纯化后的抗体显示，使用SDS-PAGE,见图5(在线）或SECHPLC，见图6（在线）确认并未检测到产品差异。测量每种样本的内毒素，两者的读数均小于0.05 EU/mg，这是使用试剂盒通常会检测到的最低下限。

为了确认改进后的工艺对抗体功能无影响，使用间接ELISA以展示人体EGFR-Fc间的结合性（Absolute Antibody 产品目录编号Pr00117-10.9）。如图4所示，细胞澄清方法对结合活性无影响。此外，两种方法所获得最终产量几乎相同，表明DE对抗体的质量和数量无影响。

LP本刊提示

无需离心操作即可轻松过滤

Sartoclear Dynamics Lab是一种创新解决方案，适用于在实验室中预过滤掉细胞培养液的细胞碎片后再进行除菌过滤。采用Sartoclear Dynamics Lab提供的解决方案可一次性完成哺乳动物细胞培养液澄清和除菌过滤。该即用型产品完全无需进行离心操作，因此可简化澄清过程。利用该技术可在几分钟内高效澄清并对细胞培养液进行除菌操作。

结论

Sartoclear Dynamics Lab V可快速澄清哺乳动物细胞培养液，无需离心操作。使用抗体瞬时转染两升的细胞培养液，然后分别使用基于标准离心澄清工艺和基于硅藻土方法进行处理后对比，可得出上述结论。

使用一系列测量方法（SDSPAGE, SEC-HPLC, ELISA和内毒素）确认最终产品的数量或质量，并未检测到任何有意义的差异，表明基于硅藻土的方法对产品质量无影响。重要的是，Sartoclear Dynamics Lab V 工艺可显著节省约85%的时间。这使得Sartoclear Dynamics Lab V成为颇具吸引力的选择，可提高澄清分泌蛋白质表达和纯化系统的生产效率和通量。