V-ATP酶在神经系统中的生物学作用

邱士伟 袁永一

中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科耳鼻咽喉研究所（北京100853）

V-ATP酶是真核生物细胞内膜系统中发现的ATP水解驱动质子泵[1-3]，在真核生物细胞溶酶体、突触小泡、囊泡、内体、高尔基体等内膜系统中均有分布[4]。主要通过水解ATP产生的能量维持氢离子转运,从而产生跨膜电化学梯度并实现生物膜内外PH值调节作用[5]。已有研究表明，V-ATP酶在细胞内吞、分泌蛋白存储、蛋白降解[6]、胞内膜性细胞器的物质转运[7]、膜融合[8]、Na+吸收[9]等细胞生物学功能中扮演重要角色，进而影响肾酸化[10]、内分泌系统、男性精子的成熟[11]、破骨细胞的骨质重吸收[12]等生理过程。目前，已报道的V-ATP酶亚基类型多达23种，不同亚基功能异常可导致多种疾病类型，比如ATP6V0A4、ATP6V1B1基因突变引起远端肾小管酸中毒[13]，ATP6V1C1、ATP6V1B2、ATP6V0A3[14]、ATP6V0D2[15]基因突变则导致骨发育及代谢方面的疾病，而ATP6V1C1在乳腺癌的发病机制中发挥一定作用[16]。最近也有研究证明ATP6V0A4[17]、ATP6V1B2[18,19]基因突变常伴随严重的感音神经性耳聋。随着神经生物学研究的日益深入，V-ATP酶在神经系统性疾病中的作用也逐渐受到关注。

1 V-ATP酶基本生物学结构

V-ATP酶属于多亚基蛋白质复合体，共含有14个亚单元，亚单元的分子量从9kDa到100kDa不等，随着电镜技术的发展，V-ATP酶各亚基结构及相互之间的空间排列关系逐渐被研究人员揭示[20]。以酵母菌为例，V-ATP酶主要含有两个功能区域：V1部分和V0部分，V1部分为亲水结构域，暴露在细胞器膜上的胞质中，呈球形，主要执行催化水解ATP的功能，由A、B、C、D、E、F、G、H八个亚基组成，V1的化学计量组成为A3B3CDE3FG3H。在中心转子的D亚基四周分布着三对A亚基和B亚基，形成一个六聚体结构。近年来，冰冻电子显微镜的发展让人们对A、B亚基的构型有了新的认识，每一对A、B亚基都包含一个具有催化功能的核苷酸结合位点，这三对亚基形成一个伪对称的三聚体结构，每对AB亚基都具有不同构象，主要呈“紧密”“松散”和“开放”状态，预计分别用来结合ATP、ADP和磷酸盐[21]。在催化过程中，三对AB亚基通过构象之间的相互转换与中心转子D亚基的旋转相耦合，D亚基通过V0部分亚单元d延伸到c亚基的环状结构。A、B亚基的周围是杆状结构，分别为中心杆和外围杆，中心杆由D、F亚基组成；外围杆由C、E、G、H亚基和V0部分a亚基的N末端组成[3]。V0部分由a、cx、cy’、cz”、d和e亚基组成，其中cx-cy’cz”属于脂蛋白，在膜的磷脂双分子层中共同围成一个环状结构，cy’上带有可以结合质子的谷氨酸残基。d亚基扣在脂蛋白环状结构的顶部，同时提供连接D亚基和F亚基的接口，使V1的中心杆与V0的环状结构相连。a亚基与c环相连且具有两个质子半通道，一个朝向细胞质，另一个朝向细胞器囊腔。当质子从胞质中进入a亚基的一个通道时，c环的谷氨酸残基与质子结合，V1部分AB亚基分解ATP使其构象改变发生旋转，通过中心杆D、F亚基连接d亚基，进而带动c环的转动将质子移动到朝向细胞器囊腔的通道。此时，a亚基的一个精氨酸残基与c环的谷氨酸残基结合降低其pKa（酸度系数）值从而释放质子，最终通过另外一个通道进入膜的另一侧[22]。

图1 V-ATP酶及其组成部分[21]V-ATP酶由V0和V1两部分构成，V1部分由A、B、C、D、E、F、G、H亚基组成，V0部分由a、cx、cy’、cz”、d和e亚基组成。Fig.1 V-ATPase and its componentsV-ATPase consists of V0 and V1 sectors.The V1 sector consists of A,B,C,D,E,F,G and H subunits,while the V0 sector consistsof a,cx,cy’,cz”,d and e subunits.

2 V-ATP酶在神经系统中的主要生物学功能

2.1 V-ATP酶维持真核细胞溶酶体系统的酸性环境

包括神经细胞在内的多数真核细胞中，高酸性环境（PH=4.2-5.3）对于溶酶体中水解酶的功能至关重要，大部分溶酶体水解酶都工作在酸性环境中，但不同水解酶的最适PH值差别较大。例如，特异性组织蛋白酶D，在PH值为3.5的时候活性最佳[23,24]，而组织蛋白酶B的最适PH值为6[25]。这些最适PH值各不相同的水解酶对于溶酶体执行各种生物学功能具有重要意义，因为底物传递到溶酶体内的主要途径依赖自噬以及内吞作用，然而当溶酶体与自噬体或者内体融合时，溶酶体会出现重塑过程，此时将引起腔内PH值上升，在此情况下，溶酶体仍然可以通过控制内部相应水解酶的表达及活化程序来协调对复杂底物的拆解和消化。上述一系列复杂反应过程一起构成了一个相互作用的动态网络系统，称为溶酶体系统[26]。

V-ATP酶主要调节细胞器内PH环境，而整个溶酶体系统所对应的酸性环境的维持与V-ATP酶功能密不可分。因此作为ATP依赖型质子泵，V-ATP酶几乎存在于所有真核细胞的溶酶体膜上[1]。

2.2 V-ATP酶在神经信号传导过程中参与神经递质释放

2.2.1 V-ATP酶提供电化学势能促进突触囊泡膜融合及神经递质释放

神经系统是机体对生理活动调节起主导作用的系统，其基本结构和功能单位是神经元，神经元之间信息传递方式表现为突触间神经递质的释放和接受。这些高浓度的神经递质主要集中于突触小泡内，并在接受到适当信号刺激后开始向胞外分泌，从而实现不同神经元之间的神经递质传递作用[27,28]。

现有研究发现，V-ATP酶所在细胞器腔内的酸性环境与蛋白质转运有关[25]。若将带有绿色荧光蛋白的碱性磷酸酶标记到液泡(包括突触小泡在内的不同囊泡型细胞器)，观察液泡活动状态，发现液泡腔内的酸性环境有利于液泡之间膜融合[29]。突触囊泡与突触前膜的融合是一个高度复杂的调控机制，囊泡脂质双分子层与突触前膜之间首先形成一个融合孔，融合孔逐渐打开到完全扩展，最终释放神经递质。形成融合孔的机制迄今仍不明确，目前有两种推测：1.V-ATP酶V0区域间接参与调控，促进囊泡脂质双分子层结构与细胞膜脂质部分融合形成融合孔[30]；2.V-ATP酶V0区域亚基中脂质结构与细胞膜脂质部分融合进而出现融合孔[31]。V0区域a亚基具有四种不同亚型（a1-a4），每种亚型分布在特定的组织细胞内。表达a1亚型的基因可通过可变剪切产生四种不同的转录本，其中一种转录本表达a1-I蛋白，主要分布于神经末梢区域。为了观察a1-I蛋白的功能，Nicolas Morel等人采用光灭活实验，即在不影响蛋白功能情况下通过基因修饰的方式在目的蛋白中插入四环素，四环素可以特异地结合一种膜渗透性双砷染料。光源照射后，染料会短暂释放活性氧，使标记了四环素的蛋白瞬间灭活。通过光灭活实验使a1-I蛋白失活后，神经递质的释放量迅速下降。然而，当使a1-I蛋白失活的同时增加突触囊泡内PH值，神经递质的下降程度并无明显差别。当仅仅改变突触囊泡内PH值，神经递质的释放量随PH值升高而降低。最终证明，V-ATP酶的V0区域可作为PH感受器参与调控突触囊泡的膜融合[32]。

2.2.2 V-ATP酶感应Ca2+内流介导的突触囊泡膜融合及神经递质释放

众所周知，Ca2+又被称为细胞内的第二信使，其浓度变化可以调节多种细胞功能，而这种调节作用主要通过结合Ca2+的钙调蛋白实现。突触小泡神经递质的释放分为诱发释放和自发释放，诱发释放发生在动作电位（或一系列动作电位）之后，而自发释放则在缺乏突触前动作电位的情况下发生。这两种形式的释放都需要Ca2+参与，较高Ca2+浓度是引发膜融合过程的前提条件。诱发释放形式下产生的较高Ca2+浓度主要与神经细胞的动作电位传递到突触前末梢、触发前膜中Ca2+电压门控通道、通道开放后Ca2+顺浓度差流入囊泡融合位点附近有关。而自发释放形式下Ca2+是如何产生的仍不明了[33]。

执行膜融合这一功能的主要蛋白被称为SNARE(可溶性NSF附着受体)家族蛋白。SNARE家族蛋白又可细分为R-SNARE（位于突触囊泡中）和Q-SNARE（位于质膜上），R-SNARE与Q-SNARE结合，组成SNARE复合体，进而介导膜融合过程，最终释放神经递质[34]。

正常情况下，没有结合Ca2+的钙调蛋白不与V-ATP酶V0区域a亚基发生结合。当Ca2+与钙调蛋白结合后，钙调蛋白便与a亚基相互作用形成一个紧密蛋白复合物。除此之外，V0区域还与R-SNARE和Q-SNARE发生相互作用[35]，Syntaxin1A和SNAP-25为Q-SNARE组成部分，V-ATP酶V0区域通过与Syntaxin1A和SNAP-25竞争性结合，破坏SNARE复合物形成。而结合了Ca2+的钙调蛋白可以干扰V0与Syntaxin1A和SNAP-25之间的竞争性结合，促进Q-SNAREs复合体形成，并结合R-SNARE催化融合。由此证明，V0与钙调蛋白一起，共同参与膜融合过程[36]。

图2 V-ATP酶V0部分参与突触囊泡与突触前膜之间的膜融合[36]。当没有钙调蛋白参与时，V0部分的a亚基通过与Q-SNARE竞争性结合破坏Q-SNARE和R-SNARE之间形成复合物影响膜融合，结合了Ca2+的钙调蛋白可以通过与V0部分的a亚基结合进而使Q-SNARE从V0部分解离与R-SNARE结合形成SNARE复合物介导膜融合过程。Fig.2 The V0 sector of V-ATPase is involved in membrane fusion between synaptic vesicles and presynaptic membranes When no calmodulin is involved,subunit a of domain V0 disrupts the assembly of Q-SNARE and R-SNARE by competitively binding to Q-SNARE.Ca2+-calmodulin can disrupt the competitive interactions of V 0 with the SNAREs,perm it the Q-SNAREs to form a complex,and also incorporate the R-SNARE and catalyze fusion.

3 展望

随着对V-ATP酶结构与功能认识的加深，对其引起的神经系统疾病病理机制的探索逐渐展开。目前，V-ATP酶与神经系统疾病相关的系统性报道相对较少，未来有望通过形态学、电生理学、遗传学、分子生物学、免疫学等多种手段对V-ATP酶缺陷导致认知和记忆障碍的致病机制进行全面阐释。