利用SSR分析浙南地区甜玉米自交系的遗传多样性

岳高红，潘彬荣，刘永安，梅喜雪，许立奎，张宗宸，周志辉

(浙南作物育种重点实验室/温州市农业科学研究院 作物研究所，浙江 温州 325006)

甜玉米是玉米属之中的一个亚种——甜质型玉米亚种，是控制胚乳的一个或多个隐性基因发生突变形成的。由于甜玉米籽粒胚乳之中含糖量高，具有营养丰富，口感香甜、脆嫩的特点，又被称之为水果玉米，深受国内外消费者的喜爱[1-2]。甜玉米起源于美洲的热带和亚热带高原地区，至今已有100多年的种植和生产历史[3-4]。20世纪60年代我国的甜玉米育种工作才起步，通过从国外引进甜玉米材料和自主选育相结合的方法，相继育成了一批普通型甜玉米、超甜型甜玉米和加强型甜玉米[5-7]。这些品种表现出产量高、适应性强、品质好、种皮薄、渣质少，既可作水果鲜食，又可速冻加工，深受农民的欢迎[8]。

温州市农业科学研究院作物研究所甜玉米育种团队长期从事甜玉米的引选和培育工作，从国内外收集了大量的甜玉米种质资源，通过多年套袋自交和定向选择，形成了一批适宜浙南地区的甜玉米自交系，并成功育成了国家审定甜玉米品种金玉甜1号[9]和浙江省审定甜玉米新品种金玉甜2号[10]。

分子标记技术已广泛应用于各种玉米材料的遗传多样性研究中[11-14]，尤其是SSR标记，因其多态性丰富、重复性稳定、共显性、选择中性、操作简便等优点，常被用来分析甜玉米自交系的遗传多样性[15-16]。为此，本研究利用SSR分子标记对浙南地区甜玉米自交系的遗传多样性进行分析，以期能揭示甜玉米自交系间的遗传背景差异，为甜玉米自交系种质的科学评价，杂种优势潜力的挖掘，以及新品种的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为37份浙南地区甜玉米自交系，均由温州市农业科学研究院提供(表1)。这批自交系是作物研究所甜玉米育种团队自2000年以来，从国内外引进、收集回来的地方品种、改良品种和推广品种等，经连年自交套袋后，分离选育出的综合农艺性状良好，株系表现稳定、一致的材料。

1.2 分子标记分析

1.2.1 DNA提取

在田间玉米苗期，每个自交系选取长势一致的5～6株幼苗混合收取嫩叶片约0.5 g，用液氮磨成粉状，用改良的CTAB法提取和纯化DNA[17]。以1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，经紫外分光光度计测定DNA浓度后，稀释至20 ng·μL-1的工作液备用，置于4 ℃冰箱储藏待用。

1.2.2 SSR分析

表1 玉米自交系信息

Table 1 Information of sweet maize inbred lines

材料编号Material No.材料来源Resource地理来源Geographical origin材料编号Material No.材料来源Resource地理来源Geographical origin01华自 Huazi台湾Taiwan19奥甜3号 Aotian No. 3广东 Guangdong0291美国U.S.A.20特甜1号 Tetian No. 1浙江 Zhejiang03795浙江Zhejiang21超甜2018 Chaotian 2018浙江 Zhejiang04海南高 Hainangao海南 Hainan22佳美1号 Jiamei No. 1福建 Fujian05华自(白)119 Huazi (white) 119台湾 Taiwan23种都1号 Zhongdu No. 1成都 Chengdu06引5(黄) Yin 5 (yellow)美国 U.S.A.24超甜4号 Chaotian No. 4浙江 Zhejiang07田5 Tian 5四川 Sichuan25超甜318 Chaotian 318浙江 Zhejiang08田15 Tian 15四川 Sichuan26奥甜8210 Aotian 8210广东 Guangdong09华7 Hua 7浙江 Zhejiang27SW503北京 Beijing10品2(白粒) Pin 2 (white grain)浙江 Zhejiang28T1539云南 Yunnan11黄金1号 Gold No. 1美国 U.S.A.29甜甜2号 Tiantian No. 2广东 Guangdong1206D18 浙江Zhejiang30白甜糯1号 Baitiannuo No. 1江苏 Jiangsu13T6广东 Guangdong31广甜5号 Guangtian No. 5广东 Guangdong14法国种 French species法国 France32浙甜7号 Zhetian No. 7浙江 Zhejiang15金银甜135(黄)浙江 Zhejiang33日本种 Japanese species日本 JapanJinyintian 135 (yellow)34新珍201 Xinzhen 201四川 Sichuan16金银蜜脆 Jinyinmicui浙江 Zhejiang35丰甜1号 Fengtian No. 1广东 Guangdong17先甜5号 Xiantian No. 5广东 Guangdong36华5 Hua 5浙江 Zhejiang18海南矮 Hainanai海南 Hainan37788-1浙江 Zhejiang

选用已报道的分布于玉米10条染色体上，多态性丰富的49对SSR标记，对37份甜玉米自交系进行PCR扩增。所有SSR引物皆由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增在ABI 9700型PCR仪上进行，反应体系总体积为15 μL，包括2×TaqPCR MasterMix(天根生化科技(北京)有限公司)7.5 μL，10 ng·μL-1正反向引物各0.5 μL，20 ng·μL-1DNA模板2.5 μL，补ddH2O至15 μL。PCR扩增反应程序为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40s，30个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，然后用简易银染法显色[18]。在医用观片灯上观察电泳凝胶成像结果，进行数据统计和拍照。

1.2.3 数据统计与分析

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳成像结果记录甜玉米各自交系在每个SSR标记下的扩增情况，按照在相同迁移位置有扩增条带记为1，无条带记为0，建立0/1矩阵数据库。用NTsys-pc 2.11软件分析每对引物扩增位点的多态性信息量(polymorphism information content，PIC)[19]和遗传相似系数[20]，按照非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)对这37份玉米自交系进行聚类分析，构建聚类分析树状图。

2 结果与分析

2.1 SSR标记特征

选用49对SSR标记引物对37份浙南地区甜玉米自交系进行PCR扩增，其中37对扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上呈现多态性，且带型稳定，重现性佳(图1)，多态性比率为75.5%。37对多态性引物对37份甜玉米自交系共扩增出233条扩增带，多态性条带有209条，每对SSR引物可产生2～16条扩增带，2～15条多态性条带，多态性比率60.0%～100.0%，PIC值0.62～0.95，平均每个标记有5.65个等位变异基因，平均多态性信息量为0.82，表明实验中所选用的SSR标记在37个甜玉米自交系间具有较丰富的多态性(表2)。

2.2 遗传相似性

根据SSR分子标记结果计算出37个甜玉米自交系间的遗传相似系数(表3)，结果显示，各甜玉米自交系间的相似性系数为0.12～0.94，其中自交系ind24与ind25的相似系数最大，达到了0.94，而自交系ind11与ind30，ind11与ind32的相似系数最小，仅有0.12，所有供试甜玉米自交系的平均相似系数为0.40，说明这些甜玉米自交系之间遗传背景差异较大，具有较丰富的遗传多样性。

2.3 基于SSR标记的聚类分析

根据37个SSR标记的结果对37份供试甜玉米自交系进行聚类分析，结果表明，所选甜玉米自交系间具有丰富的遗传变异。在遗传相似系数0.39时，可以将供试的37份甜玉米自交系分为3大类群(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)(图2)。第Ⅰ类群只有来自佳美1号和新珍201育的2个自交系，这两个自交系之所以与其他自交系有较大的遗传差异，可能是由于其原杂交种中渗入了普通玉米的遗传片段，并在自交过程中被保留了下来，这还有待进一步的实验予以验证。第Ⅱ类群包括来自华自(白)119、引5黄(自53)、法国种、黄金1号和日本种的5份自交系，主要来源于境外引进的玉米材料，这些材料往往保留原有玉米品种的部分特征特性，因而遗传差异较大，独立聚类成一个类群。第Ⅲ类群包括30份自交系，主要是来自国内选育甜玉米品种或地方农家种的后代选系。根据其田间表现及自交选育过程的历年记载，又可将其分为两个亚群：第1亚群包括来自91、795、田5、田15、华7、品2白粒、06D18繁殖、T6、先甜5号、种都1号、甜甜2号和广甜5号的共12份自交系材料，主要是在原始基础材料自交过程中有目的地以甜度高、皮渣率低、风味好等品质选择为标准定向选育而成的自交系；第2亚群包括来自华自、海南高、金银甜135(黄)、金银蜜脆、海南矮、奥甜3号、特甜1号、超甜2018、超甜4号、超甜318、奥甜8210、SW503、T1539、白甜糯1号、浙甜7号、丰甜1号、华5和788-1的共计18份自交系材料，这些自交系都是在原始基础材料自交过程中有目的地以长势旺盛、综合性状良好、产量高等农艺性状为标准定向选育而成的自交系。

电泳泳道编号与表1材料编号相同。Code of electrophoretic lane in the figure was the same as the material No. in Table 1.图1 供试甜玉米自交系SSR分子标记phi092电泳图谱Fig.1 Electrophoresis profiles amplified by SSR molecular marker phi092 in sweet maize inbred lines

表2 37对多态性SSR引物信息

Table 2 Information of 37 pairs of polymorphic SSR primers

编号No.引物名称Primername前引物序列Forward primer sequence(5'-3')后引物序列Reverse primer sequence(5'-3')总带数Totalfragmentsnumber多态性带数Polymorphicfragmentsnumber多态性比率Polymor-phismratio/%多态性信息量PIC1Umc1269TATATTAGAGGCACCTCCCTCCGTAGCTGCTTCAGCGACTTTGG99100.0 0.93 2Umc1422GAGATAAGCTTCGCCCTGTACCTCCTCATCGCGATCTCCCAGTC44100.0 0.83 3umc1318ACTTCGTCTAGTGTCCCTCCGTTTGCCAGATTAAAAGCAACACAAGA33100.0 0.74 4phi047GGAGATGCTCGCACTGTTCTCCTCCACCCTCTTTGACATGGTATG66100.0 0.90 5phi031GCAACAGGTTACATGAGCTGACGACCAGCGTGCTGTTCCAGTAGTT1414100.0 0.95 6phi051CGACATCGTCAGATTATATTG-CAGACCAGGCGAAAGCGAACGACAACAATCTT22100.0 0.70 7phi065AGGGACAAATACGTGGAGACACAGCGATCTGCACAAAGTGGAGTAGTC33100.0 0.79 8phi053 CTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGAC AACCCAACGTACTCCGGCAG55100.0 0.84 9phi050TAACATGCCAGACACATACGGACAGATGGCTCTAGCGAAGCGTAGAG33100.0 0.78 10phi083CAAACATCAGCCAGAGACAAGGACATTCATCGACGCGTCACAGTCTACT44100.0 0.82 11phi014AGATGACCAGGGCCGTCAACGACCCAGCTTCACCAGCTTGCTCTTCGTG55100.0 0.85 12phi027CACAGCACGTTGCGGATTTCTCTGCGTACGTACGACGAAGACAC44100.0 0.79 13phi077GAGAAGAGGATCAGGTTCGTTCCACGCGTTGTACATCTTGCCTGCTT33100.0 0.78 14phi080CACCCGATGCAACTTGCGTAGATCGTCACGTTCCACGACATCAC1010100.0 0.92 15phi072ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGC-CTTGACAGCGCGCAAATGGATTGAACT11763.6 0.88 16phi085AGCAGAACGGCAAGGGCTACTTTTGGCACACCACGACGA6466.7 0.81 17phi087GAGAGGAGGTGTTGTTTGACACACACAACCGGACAAGTCAGCAGATTG33100.0 0.73 18phi092GTGGGGGAGCCTACTACAGGGACGAGGCCATCATCACGGT141392.9 0.95 19phi114CCGAGACCGTCAAGACCATCAAAGCTCCAAACGATTCTGAACTCGC161593.8 0.94 20phi116GCATACGGCCATGGATGGGATCCCTGCCGGGACTCCTG1010100.0 0.93 21phi126TCCTGCTTATTGCTTTCGTCATGAGCTTGCATATTTCTTGTGGACA1111100.0 0.92 22phi96100AGGAGGACCCCAACTCCTGTTGCACGAGCCATCGTAT10660.0 0.86 23phi4488880CGATCCGGAGGAGTTCCTTACCATGAACATGCCAATGC5360.0 0.66 24bnlg1203GACCCGTCTCTCTTGAGTGCGTCTGTCTGCACCCGTTTTT151066.7 0.91 25Umc1065ACAAGGCCATCATGAAGAGCAGTACACGGTCTGGCACACTAACCTTAT77100.0 0.88 26bnlg1538CAGCCGAAGACGAAGCCGTGGTGAACGAACGAGCAA4375.0 0.79 27bnlg2238TGCCACTCAAGCCTTCTTTTTTCTGATTGCAGTGCAGACC151173.3 0.92 28ZAG107GCAACTAGAAGTAGATGGCTTGT-TATGGCAACAACAAGTGGCTGGCTAGGGT-GAA 44100.0 0.82 29bnlg391CAGATATCACAGCATCAGAAGATCAAAAATGTAAGAACTTGTTTGGGATT55100.0 0.83 30phi024ACTGTTCCACCAAACCAAGCCGAGAAGTAGGGGTTGGGGATCTCCTCC22100.0 0.70 31phi002CATGCAATCAATAACGATGGCGAGTTTAGCGTAACCCTTCTCCAGTCAGC22100.0 0.62 32phi064CCGAATTGAAATAGCTGCGAGAAC-CTACAATGAACGGTGGTTATCAA-CACGC44100.0 0.81 33phi048GCAAACCTTGCATGAACCCGATTGTCAAGCGTCCAGCTCGATGATTTC22100.0 0.68 34phi127ATATGCATTGCCTGGAACTGGAAG-GA AATTCAAACACGCCTCCCGAGTGT33100.0 0.77 35phi112TGCCCTGCAGGTTCACATTGAGTAGGAGTACGCTTGGATGCTCTTC33100.0 0.78 36phi073GTGCGAGAGGCTTGACCAAAAGGGTTGAGGGCGAGGAA22100.0 0.69 37phi076TTCTTCCGCGGCTTCAATTTGACCGCATCAGGACCCGCAGAGTC44100.0 0.81 合计Total23320993.3

图2 基于SSR标记的37份甜玉米自交系的聚类树状图Fig.2 Dendrogram of 37 sweet maize inbred lines based on SSR markers

3 讨论

SSR分子标记因其广泛分布于全基因组，具有稳定性高、重现性佳、等位基因多态性丰富等优点，被广泛用于各种农作物的遗传多样性分析[19-22]。黄君等[23]利用56个SSR标记对54份甜玉米自交系进行分析，检测到155个等位基因变异，平均每对引物检测到2.77个等位基因，变异范围为2～5个，平均多态性信息含量为0.42。张姿丽等[15]采用40对SSR引物在48份超甜玉米自交系中检测到86个等位基因变异，平均每个标记检测到的等位基因变异为2.15个，平均多态性信息含量为0.49。李锐等[12]以SSR标记对144份甜玉米群体进行遗传多样性分析，40个SSR位点共检测出343个等位变异，每对引物平均检测出8.58个等位变异，平均多态性信息含量为0.76。本研究利用37对多态性SSR引物在37份甜玉米自交系中检测到209条多态性条带，每个位点可检测到2～15个等位基因变异，平均等位基因数5.65，平均每个SSR标记的PIC为0.82，平均等位基因位点数高于黄君等[24]和张姿丽等[15]的实验结果，多态性信息含量PIC值均高于上述研究[12，15，23]结果，表明供试甜玉米自交系间的遗传差异较大，所筛选的引物代表性较好，能够检测出自交系丰富的遗传多样性。

玉米自交系之间的遗传多样性差异越大，可表现出越强的适应性，杂交种亲本间的遗传差异性直接决定了是否能够得到杂种优势潜力大的杂交种后代[24]。因此，客观地评价甜玉米自交系之间的遗传多样性对育种具有重要的意义。利用SSR分子标记技术进行甜玉米自交系的遗传多样性分析，既可避免遗传信息的错判，又可根据遗传距离的远近为甜玉米杂种优势的利用及强优势组配的选择提供理论指导。本研究中UPGMA聚类结果显示，37份甜玉米自交系间的遗传相似系数在0.12～0.94，说明供试材料间的遗传差异较大，反映了自交系来源广泛，自交系间的遗传多样性水平较高。聚类结果将甜玉米自交系划分为三个类群，第Ⅰ类群，认为是其遗传基础中渗入了普通玉米的部分基因，因此遗传背景差异较大；第Ⅱ类群集中了从境外引入的甜玉米材料的自交后代，保留了原有品种的特征特性，与国内甜玉米品种、株系间存在较大的遗传差异；第Ⅲ类群基本上是国内选育甜玉米品种或地方农家种的后代选系。由此可见，UPGMA聚类分析的划分结果与浙南地区甜玉米自交系的系谱来源及地理分布基本吻合。

本研究对甜玉米自交系的遗传变异性进行了分析和评价，有利于甜玉米资源的保存、利用和新品种的选育。第Ⅰ类群中的自交系与其他两个类群自交系的遗传距离较大，表明相互之间的亲缘关系较远，基因交流比较有限。在杂交选育方面可以选择遗传距离相对较大且遗传相似性较低的自交系作为亲本，有可能获得具有较大杂种优势的杂交种。另外，甜玉米新品种的选育不应当局限于杂种优势和品质改良，还需要将配合力、抗病性、抗虫性和耐逆性等纳入到育种目标中，因此，建议在今后的甜玉米育种工作中引进配合力、抗病性、抗虫性、耐逆性强的甜玉米种质资源，在自交系的选育中增加对其配合力、抗病性、抗虫性和耐逆性的评价，结合分子标记技术，提高甜玉米育种的效率和效果。