盐度、温度和光照对耐高温角毛藻藻株生长的影响

栾会妮 ，梁 亚 ，杨 磊 ，王珊珊 ，丛文虎 ，刘振华

（1.威海海洋职业学院海洋生物与医药系，山东威海 264300；2.威海市微藻种质资源开发工程技术研究中心，山东威海 264300）

角毛藻Chaetoceros是水产经济动物幼体的优质生物饵料，其富含二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳四烯酸（ARA）等高度不饱和脂肪酸。但目前，大多角毛藻不耐高温，例如旋链角毛藻Chaetoceros curvisetus[1]最适宜生长温度为20℃、角毛藻Chaetoceros sp.SHOU-98[2]的最适生长温度为22.3℃以及纤细角毛藻Chaetoceros gracilis[3]最适生长温度为20℃。在高温季节，传统的角毛藻难于高效培养和稳定供应于海胆等海洋动物的人工育苗，影响育苗效益，因此筛选适应性强、耐高温的角毛藻藻株对解决夏季高温生物饵料缺乏问题具有重要意义。此外，微藻生长受到许多环境因子如光照、温度、盐度、营养盐成分等的影响，任何一种因子的缺乏或过量都会导致胁迫的产生，从而对微藻的生长产生不同程度的影响[1-7]。

本研究选用威海市微藻种质资源开发工程技术研究中心提供的可在水温高达33℃时能正常生长繁殖的角毛藻藻株作为研究对象。通过单因子实验方法研究盐度、温度和光照强度对耐高温角毛藻藻株生长的影响，以期为高温季节中间球海胆Strongylocentrotus intermedius、太平洋牡蛎Crassostrea angulata、魁蚶Scapharca broughtonii和毛蚶Scapharca subcrenata等育苗中耐高温角毛藻藻株开发利用提供基础性资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用角毛藻Chaetoceros sp.藻株属硅藻门Bacillariophyta、中心硅藻纲Centricae、盒形藻目Biddulphiales、角毛藻科Chaetoceraceae、角毛藻属Chaetoceros，由威海市微藻种质资源开发工程技术研究中心筛选和提供。该角毛藻藻株带面观呈正方形或长方形，大小(3.02～5.94)×(3.67～8.19)μm，角毛长为细胞长度的2～3倍，绝大多数为单个细胞，少数2个细胞相连成群体，老化时会分泌胶质形成胶群体。该株角毛藻夏季高温季节实验室三角烧瓶内水温为32℃～33℃时能够较好地生长繁殖。海水取自桑沟湾自然海区，自然海水经24 h沉淀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，加热煮沸消毒并自然冷却，用超纯水稀释的方法调配低盐度，使用经高压蒸汽灭菌的分析纯NaCl调配高盐度。

1.2 培养方法和条件

采用单因子的实验方法，研究耐高温角毛藻藻株的生长繁殖规律。培养液采用f/2营养配方。取指数生长期的耐高温角毛藻藻株，接种于500 mL的三角烧瓶中，接种后培养液和藻液共300 mL，设3个平行样，初始种群密度相同均为(3.19±0.00)×104个·mL-1，置于光照培养箱中，以日光灯为光源，光周期为12 L:12D，每天固定时间摇瓶4次。

1.2.1 盐度对耐高温角毛藻藻株生长影响的试验

设置盐度为 2.5、5、10、15、20、25、30、35，共 8 个盐度梯度。光照强度为 3 000 lx，培养液温度为 30 ℃，pH为8.2，连续测定17 d。

1.2.2 温度对耐高温角毛藻藻株生长影响的试验

设置5个温度梯度：15℃、20℃、25℃、30℃和35℃，光照强度为3 000 Lxlx，培养液盐度为30，pH为8.2，连续测定15 d。

1.2.3 光照强度对耐高温角毛藻藻株生长影响的试验

设置5个光照强度梯度：1 000 lx、3 000 lx、5 000 lx、7 000 lx和9 000 lx，培养液温度为 30℃，培养液盐度为30，pH为8.2，连续测定15 d。

1.3 耐高温角毛藻藻株生长检测

每天在同一固定的时间用血球计数板法并结合分光光度法测定种群密度[6]。计算比生长率，公式[8]为：

式中：μ—比生长率，d-1；N0—培养初始藻细胞密度，×104个·mL-1；Nt—经过 t时间后培养液中的藻细胞密度，×104个·mL-1；t—培养时间，d。

1.4 数据处理和分析

结果以平均值±标准差（Mean±SD）表示，采用 SPSS 22.0软件进行单因素方差分析并作Duncan多重比较，以P＜0.05表示差异显著。并对耐高温角毛藻藻株的比生长率进行回归分析，求算最适生长盐度、温度和光照强度及适宜生长区间[9-12]。

2 结果与分析

2.1 盐度对耐高温角毛藻藻株生长的影响

图1为不同盐度下耐高温角毛藻藻株生长密度随培养时间的变化趋势。由图1可见，初始种群密度相同，均为（3.19±0.00）×104个·mL-1，耐高温角毛藻藻株在本研究中设置的盐度梯度2.5～35范围内均能生长；总体上，随着盐度的增加角毛藻藻株种群密度增加。随着培养时间的增加，盐度 15、20、25、30、35 处理组均表现为种群密度先增加后减少的变化趋势，其中，在第1～3 d增长缓慢，第4 d开始至第10 d增长较为迅速，从第11 d开始增长趋缓，第13 d起种群密度逐渐开始下降。盐度2.5、5和10处理组大部分时间种群密度显著低于其他处理组但一直呈上升趋势。盐度30处理组耐高温角毛藻藻株的种群密度在第5 d、第7 d～第14 d显著高于其他处理组（P＜0.05），其中第12 d，种群密度高达(240.71±3.34)×104个·mL-1，平均值的95%的置信区间下限、上限分别为232.41×104个·mL-1、249.01×104个·mL-1，第 13 d～第 17 d，种群密度逐渐下降，第 17 d 时其种群密度仅高于盐度2.5、5和35处理组，而低于其他处理组。盐度10处理组从16 d起种群密度显著高于其他处理组（P＜0.05）。盐度2.5和5处理组在整个实验期间种群密度一直显著低于其他处理组（P＜0.05）。

图1 不同盐度下耐高温角毛藻藻株生长密度的变化Fig.1 Changes of population density of of high temperature resistant Chaetoceros sp.algae strain under different salinities

微藻三级培养时为使微藻达到一定种群密度、新鲜且提高培养池循环利用率，一般不超过5 d，并且由图1可以看出培养11 d，盐度25、30和35处理组种群密度出现拐点开始下降，因此对培养5 d和培养11 d的各盐度梯度的比生长率进行了分析。表1为不同盐度梯度下耐高温角毛藻藻株的比生长率。由表1可知，培养5 d，各组间比生长率均差异显著（P＜0.05），其中盐度35处理组生长最旺盛，比生长率为0.798±0.003，显著高于其他组（P＜0.05）；对不同盐度下耐高温角毛藻藻株比生长率回归分析得：y=-0.000 4 x2+0.025 3 x+0.422 3(R2=0.833 4)，由回归方程得最适盐度为31.6，适宜盐度范围为 17.3～46.0。培养11 d，盐度30和35处理组种群密度开始下降，各组间比生长率均差异显著（P＜0.05），其中盐度30处理组生长最旺盛，比生长率为0.393±0.003，显著高于其他组（P＜0.05）；对不同盐度下耐高温角毛藻比生长率回归分析得：y=-0.000 07 x2+0.004 3 x+0.329 3(R2=0.941 3)，由回归方程得适宜盐度范围为7.0～54.5，最适盐度为30.7。

由此可见，培养前期即第1 d～第12 d，随着盐度的升高种群密度增加，高盐处理组（盐度35和30）生长优于中盐处理组（盐度25、20和15），中盐处理组生长优于低盐组（盐度2.5、5和10）；培养中期阶段即第13 d～第15 d，高盐度处理组至中盐度处理组种群密度逐一出现拐点并开始下降，低盐度处理组种群密度仍呈现持续增加趋势，盐度30处理组种群密度从第5 d开始显著高于其他处理组直至第14 d；培养后期即第16 d和第17 d盐度10处理组生长优于其他处理组，盐度15～35范围内，随着盐度的降低种群密度增加，盐度2.5和盐度5生长仍差于其他处理组。

表1 不同盐度下耐高温角毛藻藻株的比生长率Tab.1 Specific growth rate of high temperature resistant Chaetoceros sp.algae strain under different salinities

2.2 温度对耐高温角毛藻藻株生长的影响

图2为15 d培养期内不同温度下耐高温角毛藻藻株生长密度随培养时间的变化情况。由图2可见，耐高温角毛藻藻株在水温15～35℃范围内均能生长。与不同盐度处理类似，前6 d，随着温度的增加，耐高温角毛藻藻株的种群密度逐渐增加且各温度处理组之间均存在显著差异（P＜0.05），并且随着培养时间的增加，各处理间均表现为种群密度逐渐增加。初始种群密度均为(3.19±0.00)×104个·mL-1，在整个培育阶段，各处理间又有所不同，15℃和20℃处理组种群密度均一直保持上升趋势，至培养结束时种群密度分别为(168.07±2.28)×104个·mL-1和(179.44±1.90)×104个·mL-1；25 ℃和 30 ℃处理组种群数量变化接近，前14 d一直呈上升趋势，第15 d才开始下降，第14 d的种群密度分别为 (151.85±1.59)×104个·mL-1和(145.53±1.46)×104个·mL-1；35 ℃处理组种群密度前 8 d增加，从第 9 d开始减少，第 8 d 的种群密度为(132.26±0.36)×104个·mL-1。

图2 不同温度下耐高温角毛藻藻株生长密度的变化Fig.2 Changes of population density of of high temperature resistant Chaetoceros sp.algae strain under different water temperature

表2为不同温度梯度下耐高温角毛藻藻株的比生长率。由表2可知，培养5 d，各处理组间比生长率差异显著（P＜0.05），35 ℃处理组比生长率高于其他处理组（P＜0.05），其比生长率为 0.722±0.000；对不同水温下耐高温角毛藻藻株比生长率回归分析得：y=-0.000 8 x2+0.051 8 x-0.131 9（R2=0.959 3），由回归方程得最适生长水温为32.4℃，适宜生长水温范围为23.0～41.8℃；培养11 d，25℃和30℃处理组间比生长率差异不显著（P＞0.05），比生长率分别为0.341±0.001和0.342±0.000显著高于35℃处理组0.318±0.001（P＜0.05）；对不同水温下耐高温角毛藻藻株比生长率回归分析得：y=-0.000 2 x2+0.006 6 x+0.279 5（R2=0.884 2），由回归方程得适宜生长水温范围为3.6～29.4℃，其中最适生长水温为16.5℃。

可见，培养第1 d～第6 d低密度阶段，随着温度的升高种群密度增加，高温处理组生长优于低温组；培养中期阶段即第7 d～第12 d，35℃处理组种群密度出现拐点并开始下降，30℃和25℃处理组种群密度仍呈现持续增加趋势，20℃处理组种群密度从第9 d开始生长优于其他处理组；培养后期即第13 d～第15 d，低温处理组生长优于高温处理组。

表2 不同温度下耐高温角毛藻藻株的比生长率Tab.2 Specific growth rate of high temperature resistant Chaetoceros sp.algae strain under different water temperature

2.3 光照强度对耐高温角毛藻藻株生长的影响

图3为不同光照强度下耐高温角毛藻藻株生长密度随培养时间的变化趋势。由图3可见，耐高温角毛藻藻株在光照强度1 000～9 000 lx范围内均能生长。1 000 lx处理组种群密度一直呈持续增加趋势，且在第2 d～第14 d种群密度均为最低；3 000 lx处理组种群密度呈先增加后期减少的趋势；5 000 lx、7 000 lx和9 000 lx处理组种群密度变化趋势基本一致，呈现前6 d种群密度持续增加，第7 d少量减少而后缓慢增加再减少的趋势。培养第1 d～第4 d，各处理组随着光照强度的增加种群密度增加，9 000 lx处理组种群密度显著高于其他处理组；培养第5 d～第6 d，5 000 lx处理组种群密度最高；第7 d～第15 d，3 000 lx处理组种群密度最高。培养前7 d最大种群密度出现在5 000 lx处理组培养第6 d，为(168.07±1.67)×104个·mL-1，平均值的95%的置信区间下限、上限分别为163.91×104个·mL-1、172.22×104个·mL-1；后 8 d最大种群密度出现在3 000 lx处理组培养第13 d，为(197.33±0.73)个·mL-1，平均值的95%的置信区间下限、上限分别为195.52×104个·mL-1、199.15×104个·mL-1。

此外，由图3可以看出，培养5 d，5 000 lx、7 000 lx和9 000 lx处理组种群密度均出现拐点，由表3可知，培养5 d，1 000 lx处理组比生长率为0.513±0.005显著小于其他处理组（P＜0.05）；3 000 lx、7 000 lx和 9 000 lx处理组间比生长率差异不显著（P＞0.05），比生长率分别为 0.768±0.000、0.773±0.001和 0.772±0.003；5 000 lx处理组比生长率 0.793±0.002显著高于其他处理组（P＜0.05）；对不同光照强度下耐高温角毛藻藻株比生长率回归分析得：y=-1×10-8x2+0.000 1 x+0.424(R2=0.885 4)，由回归方程得最适光照强度为5 000.0 lx，适宜光照强度范围为2 403.9～7 596.2 lx。培养11 d，1 000 lx处理组比生长率为 0.343±0.002显著小于其他处理组（P＜0.05）；3 000 lx和 5 000 lx处理组比生长率显著高于其他处理组（P＜0.05）；对不同光照强度下耐高温角毛藻藻株比生长率回归分析得：y=-1×10-9x2+0.000 01 x+0.334 6(R2=0.758)，由回归方程得最适光照强度为5 000.0 lx，适宜光照强度范围为996.7～10 996.7 lx。

图3 不同光照强度下耐高温角毛藻藻株生长密度的变化Fig.3 Changes of population density of of high temperature resistant Chaetoceros sp.algae strain under different light intensities

可见，培养前期即第1 d～第4 d低密度阶段，随着光照强度的增加种群密度增加，高光照强度处理组生长优于低光照强度处理组；培养中期即第5 d～第6 d，5 000 lx处理组生长优于其他处理组；培养后期即第7 d～第15 d，3 000 lx处理组生长优于其他处理组；1 000 lx处理组在培养的大部分时间里生长显著差于其他处理组（P＜0.05）。

表3 不同光照强度下耐高温角毛藻藻株的比生长率Tab.3 Specific growth rate of high temperature resistant Chaetoceros sp.algae strain under different light intensities

3 讨论

3.1 盐度对耐高温角毛藻藻株生长的影响

盐度是影响微藻生长的一个重要环境因子，盐度从渗透压、营养盐吸收及悬浮性等方面影响硅藻生长[13]。该耐高温角毛藻藻株在试验设计的盐度2.5～35的范围内均可以生长繁殖，从盐度的适应能力看，为广盐种。随着盐度的增加耐高温角毛藻藻株种群密度增加，并且由盐度和比生长率回归方程得出其适宜盐度范围为17.3～46.0，最适盐度为31.6，其最适盐度高于茅华等[1]报道的旋链角毛藻Chaetoceros curvisetus（最适盐度25）、曾蓓蓓等[2]从上海奉贤一处半咸水池塘分离角毛藻Chaetoceros sp.SHOU-98（(最适盐度12.6）)以及张平等[7]报道的牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri（最适盐度21.0），由此可见，该耐高温角毛藻藻株对高盐适应能力强。试验用耐高温角毛藻藻株虽然可以在盐度2.5和5的条件下生长繁殖，但比生长率低，生长缓慢，并且盐度2.5和盐度5均低于由培养5 d不同盐度下比生长率回归分析得适宜盐度范围17.3～46.0和培养11 d不同盐度下比生长率回归分析得适宜盐度范围7.0～54.5，当盐度低于其适宜的范围，会影响微藻细胞的渗透压，降低了其对营养物质的利用能力，从而抑制了生长[14]。该耐高温角毛藻藻株虽为广盐种，对高盐度的适应能力强，但盐度5以下生长受到明显抑制。

3.2 温度对耐高温角毛藻藻株生长的影响

温度是影响微藻生长的一个重要环境因子，不同微藻适宜的温度范围不同[9]。该耐高温角毛藻藻株在试验设计的15～35℃的范围内均可以生长繁殖，从对温度的适应能力看，为广温种。培养前期随着温度的升高种群密度增加，35℃处理组和30℃处理组生长显著优于其他处理组；由温度和比生长率回归方程得出其适宜生长温度为23.0～41.8℃，最适温度为32.4℃，其最适温度与RENAUD，et al[15]报道的澳大利亚热带地区角毛藻的适宜温度33～35℃接近，远高于旋链角毛藻Chaetoceros curvisetus[1]最适宜生长温度20℃、角毛藻Chaetoceros sp.SHOU-98[2]的最适生长温度22.3℃以及蒙天[3]报道的纤细角毛藻Chaetoceros gracilis最适生长温度20℃，由此可见该耐高温角毛藻藻株对高温适应能力强。35℃高温处理组在第9 d种群密度开始下降，主要原因是该处理组在第1 d～第8 d藻细胞繁殖最快，消耗了大量的营养盐。35℃处理组在培养第9 d开始进入死亡期，30℃和25℃和处理组在第15 d开始进入死亡期，20℃和15℃处理组在试验结束时仍处于相对生长下降期，因为温度不仅能够调节体内酶的活性[16]而且还影响细胞分裂周期及营养物质的吸收利用[17]。培养5 d比生长率回归方程和培养11 d比生长率回归方程得出的最适温度差异显著，也说明了温度变化能够显著影响耐高温角毛藻藻株的生长周期，这一点与茅华[1]的研究结论一致。15℃处理组在培养第2 d～第9 d种群密度显著低于其他处理组(P＜0.05)表明该耐高温角毛藻藻株在15℃以下生长缓慢。该耐高温角毛藻藻株为广温种，对高温的适应能力强，但温度15℃以下生长缓慢。

3.3 光照强度对耐高温角毛藻藻株生长的影响

光照强度是影响微藻生长的一个重要环境因子，光照既可以通过一系列铁氧还原蛋白和硫氧还原蛋白参与信号传导，激活质体中的乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）[18]还决定着硅藻光合作用效率对藻类的生长速率起着重要的作用[19]。该耐高温角毛藻藻株在试验设计的1 000～9 000 lx的范围内均可以生长繁殖，从对光照强度的适应能力看，试验用藻株对光照强度的适应范围宽。由光照强度和比生长率回归方程得该耐高温角毛藻藻株适宜光照强度范围为 2 403.9～7 596.2 lx，最适光照强度为 5 000.0 lx（90 μmol·m-2·s-1），其最适光照强度高于角毛藻Chaetoceros sp.SHOU-98[2]最适光照强度28 μmol·m-2·s-1，远低于牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri[3]最适光照强度200 μmol·m-2·s-1和纤细角毛藻Chaetoceros gracilis[3]（Chaetoceros gracilis）250 μmol·m-2·s-1。浮游植物的生长速率随着光照强度从0到某一个最适光照强度的增加而相应地增加[20]，本研究结果也反映了这一规律。但光照强度太强，会导致光合色素的光氧化和细胞中的某些酶受到氧化伤害而使光合作用速率下降[21]，7 000 lx和9 000 lx处理组在培养后期表现得尤为明显。1 000 lx处理组在培养第2 d～第13 d种群密度显著低于其他处理组(P＜0.05)表明该耐高温角毛藻藻株在1 000 lx以下生长受到明显抑制。该耐高温角毛藻藻株为广光照种，但光照强度1 000 lx以下时生长缓慢。

4 结论

不同盐度、温度和光照强度对耐高温角毛藻藻株生长均有显著影响（P＜0.05）。本研究中所选用的耐高温角毛藻藻株适宜盐度范围为17.3～46.0，其中最适盐度为31.6，当盐度低于5时生长受到明显抑制。耐高温角毛藻藻株适宜温度范围为23.0～41.8℃，最适温度为32.4℃，当温度低于15℃时生长缓慢。耐高温角毛藻藻株适宜光照强度范围为2 403.9～7 596.2 lx，其中最适光照强度为5 000.0 lx，当光照强度低于1 000 lx时生长受到明显抑制。耐高温角毛藻藻株具有可适应广温、广盐和广光照的特性，并且耐高温、高盐，具有很好的生产应用前景。