血清反复冻融对肾功能指标检测结果的影响

刘佳佳，石莲花，金有训，陈 燕，吕 虹，张国军，康熙雄

（1.首都医科大学附属北京天坛医院实验诊断中心，北京100070；2.中国计量科学研究院，北京100029；3北京市免疫试剂临床工程技术研究中心，北京100070）

检测血清、血浆等血液样本中的生物活性分子是临床检验和医学研究的重要内容，样本分析前阶段包括样本处理和存储是影响检测结果的关键部分［1-2］。研究［3-4］表明，当低温冷冻储存时血清中各成分是较稳定的，为保持生物活性分子最好的性能，最好是解冻并且只使用一次来防止重复冻融对检测结果的影响，这是因为反复冻融可能导致血清标本中生物分子的降解、活性的改变和不溶性沉淀物的产生。然而，在临床工作或科研中，有时样本多次冻融是不可避免的，这可能与样本复查或者对重新冻结的样本进行额外的分析有关。血清中的各种成分对反复冻融的次数可能有不同的耐受性，这一问题的相关研究数据有限，发表的论文往往不具备高的统计能力。因此，我们在严格质量控制前提下进行了本研究，提供了关于不同储存温度反复冻融对30例血清中肾功能相关生化指标（血肌酐、尿素氮、尿酸）结果的影响。

材料和方法

1 一般资料

1.1 样本来源 样本来源于首都医科大学附属北京天坛医院门诊就诊患者空腹静脉血，全部为分离胶采血管真空采血，采集后的血液室温保存不超过1 h，2000 r/min离心5min，将血清与血细胞分离。血清肉眼观非脂血、高胆红素血和溶血。

1.2 试剂来源 CREA、BUN、UA检测试剂盒由日立公司提供。

1.3 仪器设备 日立LABO SPECT 008生化分析仪，高速低温离心机，-20℃冷冻冰箱，-80℃冷冻冰箱等。

2 方法

收集肉眼观非脂血、高胆红素血和溶血的血清样本30例并编号，立即对CREA、BUN、UA浓度进行检测（原始水平），测定后将每例样本分2份分装于5mL试管中，并用封口膜进行封口，防止血清样本蒸发，分别直立放入-80℃、-20℃冰箱中冷冻保存，2 h后再解冻复融，将样本反复混匀，去掉封口膜，2000 r/min离心5min后上机对CREA、BUN、UA复测。检测完成后再将标本用封口膜封口，各放入-80℃、-20℃冰箱中冻存，如此反复冻存5次。将-80℃、-20℃不同冻融次数后CREA、BUN、UA浓度检测结果（T1～T5）与原始水平（T0）进行比较，同时计算每例样本相对于原始水平变化百分比，计算公式为：（Cn-C0）/C0×100%，其中Cn表示该样本冻融第n次时检测指标的浓度，C0表示该样本的原始浓度。本研究中的3个检测指标均有低、中、高三个水平质控品随之检测，以保证检测数据稳定可靠。

3 统计学处理

原始数据记录于Excel表格中，各组数据均进行正态性检验，均为非正态性分布，实验结果采用中位数（四分位数范围）［M（P25～P75）］表示。采用SPSS 21.0统计软件处理数据，同一检测指标不同组间浓度比较采用相关变量非参数Friedman检验，有统计学差异者进行配对样本Wilcoxon检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 质控血清测试结果

3个指标（CREA、BUN、UA）的质控血清随样本各自进行测试，批间变异系数＜5%（见表1）。

表1 各成分检测方法及质控血清测试结果

2 血清冻融前后各指标浓度变化分析

30例样本在-80℃冰箱储存贮反复冻融5次后CREA、BUN、UA均发生明显变化，Friedman检验表明差异有统计学意义（χ2＝101.68，P＜0.05；χ2＝113.13，P＜0.05；χ2＝128.91，P＜0.05）。经配对Wilcoxon检验，第2次复融后CREA、BUN、UA检测结果与初始水平相比均差异有统计学意义（Z＝-4.09，P＜0.05；Z＝-3.13，P＜0.05；Z＝-2.70，P＜0.05）。-20℃冰箱冻存的血清样本5个冻融循环后CREA与UA较稳定，未出现明显的升高或降低（χ2＝9.42，P＝0.093；χ2＝10.74，P＝0.057），而BUN的浓度发生了改变（χ2＝45.09，P＜0.05），经配对Wilcoxon检验，经过2次解冻后BUN检测值较原始水平即发生了显著性变化（Z＝-3.46，P＝0.001），见表2、表3，图1。

表2 血清-80℃冻融前后肾功能指标浓度变化［M（P25～P75）］

表3 血清-20℃冻融前后肾功能指标浓度变化［M（P25～P75）］

图1 血清在-80℃、-20℃冰箱冻融前后肾功能实验室指标浓度改变（%）

讨 论

血清中生物活性分子（包括蛋白质、代谢物、离子等）的变化可以反映人体动态健康状态，某些分子可作为疾病诊断或预后的生物标志物［5-6］。肾脏疾病是临床常见病，种类较多，各种肾脏疾病均可造成机体物质代谢紊乱以及体液生物化学的改变［7-8］。肾功能常用生化检测指标（CREA、BUN、UA）能够反映肾小球滤过功能并估计损害程度，是发现肾功能改变的重要指标，对于早期干预、防止肾功能进入到终末期、监测肾毒性药物的不良反应至关重要［9-11］。因此，肾功能指标检验在临床应用越来越普遍。一些基层实验室标本量不多，可能不会做到即时检验，加之样本结果日后复查或用于科学研究，因此，样本检测结果可能会受到额外的反复冻融的影响［12］。

试剂厂商一般都提醒避免反复冻融血清，并建议对血清进行分装冻存［13］。关于血标本冻融对生物活性分子检测水平的影响，国内外早有报道。司学众等［14］的研究显示，样本冻融2次后，血甲状腺功能指标，包括TSH、TT3、TT4、FT3、FT4发生显著改变。CUHADAR等［15］研究了血清冻融1～10次后各生化成分改变，结果显示，在-20℃冻存条件下，血清冻融10次后AST、ALT、GGT、HDL胆固醇、葡萄糖、肌酐未见显著性变化，而白蛋白在冻融7次后发生显著升高，尿素氮和钙离子在3次冻融后发生改变，总蛋白和尿酸是最不稳定的，分别在冻融1次和2次即发生改变。Hillebrand等［16］对血浆和血清中内分泌相关参数进行分析发现，-20℃下冻存的标本2个冻融循环后血浆肾素活性升高，经过3个冻融循环促肾上腺皮质激素（ACTH）浓度发生显著下降，而其他参数包括甲状腺素、胰高血糖素、促甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白等经过3次冻融循环未发生明显改变。以上研究表明，血清冻融对不同蛋白质、电解质、细胞因子等的影响不同。

本文通过对30例血清样本冻融5次连续观察发现，-80℃冻存的血清样本经过1个冻融循环后BUN检查结果与基准水平值比较差异即有统计学意义（P＜0.05），反复冻融2次以上的血清样本CREA、BUN、UA检测结果与基准水平相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。 -20℃冻存的血清标本经过1次冻融循环后BUN检测值发生显著性改变（P＜0.05），而CREA和UA较稳定，5次冻融循环后未出现明显的升高或降低。根据质控结果，本研究标本测定结果稳定且可靠。

结合历史文献报道以及本研究结果，可以认为反复冻融对血清中肾功能指标结果会产生影响，但这些分子对不同存储温度及反复冻融次数的耐受力不同。BUN是其中最不稳定的分子，应避免冻存后检测。对于CREA和UA而言，在-80℃下存储时的血清标本应进行分装，冷冻的血清样本应该解冻一次以保持最佳的性能；在-20℃冰箱中冷冻的血清受冻融循环影响较小，在5次以内冻融情况下，可以不对血清进行分装保存。本实验有利于指导标本的保存和复查工作，提示临床检验者和科研工作者应避免冻融循环对检测结果的影响，以保证实验结果的准确性。至于更多次冻融循环对血清肾功能实验室指标的影响以及冻融次数对其他血清中生物活性分子的影响，还有待继续研究。