SD乳鼠骨髓间充质干细胞体外改良筛选法培养及鉴定

李 楠，翁军权，谢华德，孙海鹏

［深圳市人民医院（暨南大学第二临床医院 南方科技大学第一附属医院）口腔科，广东 深圳518020］

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种存在于骨髓支持组织中具有多向分化潜能的成体干细胞，在相关的培养基诱导下可以分化为不同的细胞系，例如骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等［1-2］。BMSCs可在体外大量培养扩增，同时能够长时间保持未分化状态，易于体外基因转入与表达，是组织工程领域理想的种子细胞，在干细胞移植、基因治疗、组织工程及再生医学等方面的研究中具有重要的意义［3］。在骨缺损区植骨愈合的过程中，植骨材料传导成骨或诱导成骨，其生物学基础是BMSCs被诱导成骨分化为骨细胞，骨细胞的数量多少取决于BMSCs的数量。虽然骨髓中存在许多细胞，但是成分非常复杂，在数量众多的骨髓单核细胞中，BMSCs的含量并不高，仅占0.001% ～0.01%［4］。因此，建立一种简单高效的BMSCs体外分离培养、纯化与扩增的方法具有十分重要的临床价值。大鼠为研究中最常用的BMSCs提取动物之一，目前常用成年大鼠骨髓的贴壁筛选法分离培养BMSCs。但是，有关人体研究显示，年龄影响BMSCs的增殖能力［5］，儿童的BMSCs增殖速度是成人的2倍以上［6］。ZHANG等［7］发现幼年大鼠BMSCs数量多于成年大鼠，因此推断供体年龄可能与BMSCs扩增能力及获取数量密切相关。ASUMDA等［8］比较4月龄及15月龄大鼠，发现15月龄大鼠BMSCs 24 h贴壁数量较少，增殖速度慢，且呈平摊放大的形态。VALYUSHINA等［9］分别从1月龄及12月龄大鼠体内分离BMSCs并进行培养，1月龄大鼠（发育早期）细胞增殖能力明显增强，12月龄大鼠（成年）体内分离出的细胞量少、增殖慢、前体细胞集落增殖能力降低。乳鼠骨髓可能含有更多的鼠类骨髓间充质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs），其增殖能力及多向分化能力可能更好。因此，本研究选用出生7 d龄SD乳鼠，采用改良的贴壁筛选法分离培养BMSCs，探究此模型及方法对BMSCs分离培养扩增的效果，评估BMSCs成骨及成脂分化功能，并且对其细胞表面标志物进行鉴定，为口腔牙槽骨骨再生的研究奠定种子细胞基础。

材料和方法

1 实验动物及试剂

成年斯泼累格·多雷（Sprague-Dawley，SD）乳鼠6只，雄性，购自广州中医药大学实验动物中心，体重5～7g，饲养于中山大学北校区动物中心SPF级大鼠饲养室，适应性喂养7 d，自由进食及饮水。小鼠抗大鼠CD34-PE、CD45-PE、CD90-FITC、CD44-FITC、CD29-FITC（R&D，USA）；OriCellTM 间质干细胞成骨分化诱导培养基、OriCellTM 间质干细胞成脂分化诱导培养基（Cyagen，苏州，中国）。

2 方法

2.1 乳鼠BMSCs的分离、培养和纯化 取6只出生7 d的SD乳鼠（图1），脱颈处死。浸泡于75%酒精溶液15 min；无菌分离出乳鼠的双侧股骨，并放置于完全培养基中浸泡，剪碎股骨，尽量使股骨骨髓腔外露，骨髓内细胞溢出；将剪碎的股骨以及骨髓细胞悬液高速震荡5 min，可见剪碎的股骨逐渐由红色变为白色（图2）；取红色的上清液，分别接种到2个25 cm2培养瓶中，置于37℃，5%CO2的孵箱中进行原代培养；原代培养24 h后半量换液，可见大量的悬浮的血细胞，48 h后全量换液，去除大部分悬浮的血细胞。之后每两天更换一次培养基，待培养瓶底壁细胞融合至85%～90%时按照一传三的比例进行传代培养。

图1 7d龄SD乳鼠

图2 7d龄SD乳鼠的股骨

2.2 绘制BMSCs的生长曲线 取第3代乳鼠BMSCs，消化离心后制备成l×104/mL密度单细胞悬液；接种在96孔培养板中，每孔200μL单细胞悬液，总共接种8个96孔培养板；每天选取1个96孔培养板，每孔加入（完全培养基：CCK-8＝10：1）混合液体200μL，在细胞培养箱内继续孵育培养2 h；应用酶标仪检测各孔OD值，记录计算均值。连续测量8d，制作细胞生长曲线。

2.3 评估乳鼠BMSCs成骨和成脂分化能力

培养第3代BMSCs细胞至50%～70%的融合，弃去完全培养液，每孔加入2mL的成骨分化诱导液进行诱导；每隔2 d换新的成骨分化完全培养基；分化诱导3周，PBS洗涤2次后加入2mL 4%多聚甲醛固定30 min，吸去4%多聚甲醛，PBS洗涤2次后每孔1 mL的茜素红染色3 min；去除染液，PBS洗2次，倒置显微镜下拍照。

培养第3代BMSCs细胞至50% ～70%的融合，弃去完全培养液，每孔加入成脂分化诱导A液2mL进行成脂诱导；3 d后，小心吸除成脂分化诱导A液，每孔加入成脂分化诱导B液2mL继续进行成脂诱导；1 d后，再更换为成脂分化诱导完全培养基A进行成脂诱导；如此更换3次后，最后用成脂分化诱导完全培养基B继续维持1周。吸去成脂分化诱导培养基，PBS洗涤，加入2mL的4%多聚甲醛固定30min后，吸去4%多聚甲醛，PBS洗涤2次，每孔加入油红“O”工作液（油红：双蒸水＝3：2，用定性滤纸过滤）1mL染色30min；去除染液，PBS洗涤两次，倒置显微镜下拍照。

2.4 流式细胞仪检测BMSCs表面标志物 取第3代的乳鼠BMSCs，制备成密度为2×106单细胞悬液，取7管单细胞悬液，每管100μL，分别加入A：5μL IgG1-PE；B：5μL IgG1-FITC；C：5μL CD34-PE单克隆抗体；D：5μL CD45-PE单克隆抗体；E：5μL CD90-FITC单克隆抗体；F：5μL CD44-FITC单克隆抗体；G：5μL CD29-FITC 单克隆抗体；各管孵育30min后，用PBS洗2次，加入缓冲液重悬，流式细胞仪检测。

结 果

1 BMSCs细胞形态学观察

原代培养：将乳鼠骨髓细胞悬液刚刚接种到培养瓶时，细胞悬液外观为红色，镜下观察到大量悬浮的圆形细胞；原代培养24 h首次半量更换培养液时，透过悬浮的圆形细胞，可见培养瓶壁上散在的贴壁细胞，针状，晶亮；原代培养48 h全量更换培养液时，可见培养瓶壁上更多的贴壁细胞，梭状，透亮；经过24 h半量换液及48 h全量换液后，培养瓶内悬浮的圆形细胞基本被清除；原代培养72 h观察到培养瓶内贴壁细胞呈长梭状，增殖迅速，开始融合；原代培养120 h观察到培养瓶内贴壁细胞增殖迅速，融合区域大约占培养瓶壁的85%～90%，长梭状或纺锤状。

原代培养第5天第一次传代，第二代细胞保持长梭状，贴壁时间短（12h内完成），增殖旺盛，大约3～4 d后就可以再次传代（图3）。

图3 接种48 h后贴壁细胞

2 BMSCs生长曲线

乳鼠BMSCs的生长曲线大体呈一个拉伸的“S”形。最初，接种第1～2天，为细胞生长潜伏期；接着，第3～6天细胞进入对数快速增殖期；然后，第6天细胞增殖达到高峰；最后，第7天细胞进入平台期，生长变慢（图4）。

图4 乳鼠BMSCs生长曲线

3 BMSCs成骨及成脂分化能力

BMSCs经成骨诱导后呈复层生长，胞体由长梭状变为多边形状，体积变大，随着时间的推移，镜下可见胞浆内逐渐出现黑色小颗粒，黑色小颗粒越来越多形成大小不等的结节，结节增多增大逐渐形成团块。经成骨诱导3周后茜素红染色在细胞外基质中可见深红色团块，提示形成钙化结节，具有较强的成骨能力（图5）。

图5 乳鼠BMSCs成骨诱导21天后茜素红染色，可见深红色团块状钙化结节

BMSCs经成脂诱导后呈复层生长，胞体由长梭状变为圆形，体积逐渐变大，随着时间的推移，镜下起初可见胞浆内出现较小折光性很强的脂滴，随后小脂滴聚集形成较大的脂滴，最后脂滴形成串珠状。经成脂诱导四周后油红“O”染色可见细胞内大小不等的串珠状橘红色脂滴，提示脂肪细胞的形成，具有较强的成脂能力（图6）。

图6 乳鼠BMSCs成脂诱导28天油红染色，可见串珠状红色脂滴

4 鉴定BMSCs表面标志物

第3代培养细胞表面抗原CD分子流式细胞仪检测结果（图7）：CD29约97.06%，强阳性表达；CD44约96.76%，强阳性表达；CD90约96.96%，强阳性表达；CD34约0.53%，阴性表达；CD45约0.96%，阴性表达。

图7 流式细胞仪鉴定分离培养BMSCs表面标志物

讨 论

目前，大鼠BMSCs体外分离培养方法较多，但无统一标准。最常用方法主要有4种：全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、免疫磁珠分选法以及流式细胞仪分选法［10］。

上世纪70年代FRIEDENSTEIN最先提出全骨髓贴壁培养法，运用该方法时，骨髓细胞中的造血细胞在原代培养接种后会悬浮生长，而BMSCs会贴壁生长，通过换液及传代使细胞分离与纯化，至今仍为应用广泛的经典方法［11］。该方法操作简便，细胞损伤较小同时细胞活性较高。与其他方法相比，全骨髓贴壁法早期保留了多种细胞，模拟体内生长环境，含有各种生长因子、促黏附物质等，细胞生长增殖迅速［12］。该方法缺点是获得的BMSCs纯度略显不足，可能含有骨髓中其他种类细胞。但也有学者实验研究证实传代与换液后该方法与密度梯度离心法获得细胞纯度无明显区别，特别是在3、4代后［12-13］。

BMSCs与其他细胞密度的不同，位于1.05～1.08个/m3密度区间，密度梯度离心法就依据这一特性，采用密度相对应的分离液将BMSCs与其他细胞分离开来［11］。密度梯度离心法优点是所获得的细胞纯度高，对细胞活性影响较小。HOU等［14］利用密度梯度离心法获得了纯度满意的BMSCs。但是与全骨髓贴壁培养法相比，该方法原代培养时间长，原因可能是培养早期BMSCs密度相对较低，分泌的生长因子不足；离心后纯化的BMSCs失去了造血系细胞的旁分泌作用；离心导致细胞流失。另外，此法分离的细胞容易出现“老化”，原因可能与离心导致的某些生长因子丧失及高速离心对细胞本身的机械损伤有关［15］。密度梯度离心法操作开放，污染机会较大，而且细胞分离液有无毒性，对细胞有无影响目前尚无定论，此法分离后得到的细胞需洗涤后才可进行移植治疗。

免疫磁珠分选法及流式细胞仪分选法是利用细胞表面特异性抗原与抗体结合进行分离。这两种方法处理细胞量大、种类广、所分离的细胞纯度最高［16］。但是BMSCs较脆弱，分选时易产生机械损伤，细胞活性受影响，甚至完全丢失。此外，这两种方法要求有一定量的骨髓组织以及特殊的仪器，费用昂贵，操作繁琐，BMSCs单克隆抗体的缺乏也限制上述分选技术的运用。

传统的BMSCs取材方法为取得大鼠股骨与胫骨后剪去干骺端膨大的部分，利用细针头将骨髓抽出［17］。谢茂松等［18］认为，股骨和胫骨的干骺端含有大量骨髓，其运用改良贴壁筛选法，保留干骺端骨

髓，从中间剪断股骨干和胫骨干，能够获取更多的

BMSCs。

细胞种植密度影响细胞的生长，密度过高引起贴壁细胞之间无足够的伸展空间，导致接触抑制；密度过低则导致分泌的细胞因子不足，影响生长及增殖，且细胞达到传代所需密度的时间延长，导致原代细胞容易“老化”，损害传代后细胞的扩增能力和分化潜能。MEIRELLES等［19］在1×109/L接种密度获得的细胞最早出现贴壁、伸展。有学者实验研究在1×106/L密度接种获取细胞数量最多［20］。有研究认为极低密度小于8×103/L传代更有利于细胞增殖与保持细胞多向分化潜能［21］。但是，全骨髓贴壁法所得细胞成分复杂，难以进行准确的BMSCs细胞计数，因此不同研究者采用的传代BMSCs密度有所不同，至今尚未有统一标准。

由于骨髓中BMSCs丰度不高，所以必须使获得的BMSCs尽可能多贴壁，有报道首次换液时间对BMSCs生长增殖有一定影响［12］。换液时间过早则许多BMSCs尚未贴壁，骨髓其他细胞分泌的促干细胞生长因子随换液而遗失；换液时间过晚一方面悬浮的造血细胞占据培养瓶壁空间，干扰BMSCs的贴壁，另一方面其他细胞可争夺营养物质，难以通过换液及时除去这些杂质细胞，抑制BMSCs的增殖，影响BMSCs纯度。庄淑波等［22］发现第5天后不再有新的细胞贴壁。有学者分别在接种后6、12、24、48、72 h进行首次换液，结果48 h组细胞数量明显高于其余各组［20］。而ZHAO等［23］在24 h首次换液获得了满意的效果。LI［12］采用培养24 h首次半量换液的方法，既部分清除了大量悬浮的造血系细胞，又保证了造血系细胞旁分泌的细胞因子对BMSCs的滋养作用。

本研究采用出生7 d龄的SD乳鼠，利用改良的全骨髓自然贴壁筛选法分离培养BMSCs。改良的全骨髓自然贴壁筛选法具体包括：①保留乳鼠股骨干骺端膨大的部分，将股骨剪碎，保留干骺端内丰度较高的BMSCs；②采用原代培养24 h首次半量换液及48 h后全量换液的方法，既清除大量悬浮的造血系细胞，同时保留造血系细胞通过旁分泌机制分泌的具有滋养BMSCs的细胞因子，获得较多数量的BMSCs，纯度较高；③在细胞传代时按照1×106/L密度接种，细胞生长及增殖较快。

迄今，尚未发现鉴定MSCs的单独特异性表面标志物，但是鉴定人类MSCs至少有3个方面的标准：①细胞贴附塑料瓶壁生长；②细胞表面表达CD73、CD90和CD105，不表达CD31、CD34和CD45；③细胞能够分化成脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞［24-25］。除去细胞表面不表达CD73和CD90或者表达异质的CD73和CD90，大鼠MSCs与人类MSCs基本类似［26-27］。由于细胞组织来源、分离培养方法的差异，因而检测到的MSCs细胞标志物亦不尽相同。

在本研究中，从7d龄乳鼠骨髓原代分离培养的细胞可以在塑料培养瓶中贴壁生长；体外诱导成功分化为骨细胞和脂肪细胞，具有多向分化潜能；流式细胞术鉴定其细胞表面强阳性表达CD29、CD44、CD90，阴性表达CD34和CD45；符合间充质干细胞的特性和标准。本研究采用7 d龄SD乳鼠全骨髓自然贴壁筛选法并进行相应改良，取得较好的效果，为口腔牙槽骨骨再生的研究奠定种子细胞基础。