肺癌自身抗体在肿瘤早期诊断和治疗中的临床应用进展

霍云丽，郭子建

（中国医学科学院北京协和医院检验科，北京100730）

肺癌是世界范围内癌症死亡的主要原因，威胁着人类的健康和生命。根据相关资料及统计学模型估计，在2012年全球约有1.41千万新发癌症病例，其中肺癌发病率为180万，占癌症发病率的13%，是癌症中诊断率最高的病种，也是全球男性、发达国家女性癌症死亡率最高的病种，在发展中国家女性死亡率仅次于乳腺癌［1］。不同于西方发达国家，中国肺癌发病率从20世纪80年代初期开始一直呈现上升趋势，而西方工业发达国家自20世纪末期开始肺癌发病率便呈下降趋势或维持相对稳定的水平，根据美国癌症协会统计数据显示2012年，世界范围内诊断为肺癌的人数大约226160，而大约有160340人死于该疾病［4］。据相关数据显示中国2015年癌症大约有新发病例429.2万和死亡病例281.4万，其中肺癌是发病率最高的肿瘤也居癌症死因之首［2］。由于缺乏早期的诊断手段导致肺癌呈低存活率、高死亡率的特点，据相关报道0期肺癌患者5年生存率高达90%以上，Ⅰ期为60%，而Ⅱ期肺癌患者的5年生存率为40%，而Ⅳ期肺癌的5年生存率仅为5%［3］。目前的现状是肺癌患者的5年生存率是所有癌症中比较低的，在过去的10年里仅轻微的改善。由于肺癌早期无特异症状及缺少有效的早期诊断的手段，使得大多数肺癌患者被确诊时已经处于疾病后期或晚期，造成了低生存率、高死亡率的现状。然而现有的肺癌的诊断技术主要依靠影像学即胸部X线检查、电子计算机断层扫描、磁共振显像（MRI）等和其他辅助检查：组织病理学。现有的影像学技术对早期癌症的诊断作用不是很大；组织病理学取材较困难，而基础研究表明体液免疫反应往往比临床症状早存在几个月甚至是几年，因此肺癌的自身抗体可以有效地对早期、局限性肺癌进行筛检，可能会增加肺癌的治愈机会［5-6］。肺癌的早期诊断可以显著地提高生存率从晚期的3.3%提高到48.8%［7］。因此，为了能发现早期的肺癌患者及识别高危人群以便提供潜在的辅助治疗，最终尽可能提高肺癌的生存率。目前有大量针对肺癌相关抗原的自身抗体的研究，这已经成为近些年的研究热点，肺癌的自体抗体的检测具有早期诊断和评估预后的价值，因此自体抗体可用于肺癌患者的早期诊断［8-12］及治疗。

1 与肺癌自身抗体相关的体液免疫应答致病机制

人体的免疫系统能够对肿瘤细胞产生免疫应答，包括体液免疫和细胞免疫。肿瘤相关抗原（TAAs）各种分子层面的改变如过表达、突变、错误折叠等可导致机体产生针对肿瘤的自身反应性细胞免疫应答［13］。通过TAAs刺激B淋巴细胞产生针对这些抗原的自身抗体，并可使抗原信号形成放大作用。这种机制使在肺癌早期能检测出高表达的自身抗体成为可能，所以监测自身抗体为临床早期诊断提供了新的依据。现在已发现的多种自身抗体既有识别已知的蛋白，也有识别许多功能未知的功能蛋白。目前已知与抗原相关的抗体有：针对睾丸肿瘤抗原 的 抗 体 如NYESO-l、SSX2、MAGE、GAGE7、CAGE、GBU4-5；针对基因突变后引起的蛋白改变的如P53；针对分化抗原的如酪氨酸酶、SOX1、SOX2、ZIC2；针对原癌基因产物的如c-myc、kras；针对热休克蛋白的Hsp-70；针对RNA结合蛋白的如Hu-C、Hu-D；针对凋亡抑制蛋白的如Survivin、livin、cIAP1以及其他如PGP9.5。

最新发现的自身抗体：

（1）ECH1（Delta（3，5）-Delta（2，4）-dienoyl-CoA isomerase）是ECH1基因编码的存在于线粒体的异构酶，是一个异构酶超家族，与多种的异构酶enoylcoa具有很高的序列相似性，特别是在这些酶蛋白的保守域中。该异构酶含有c-末端的含有过氧化物酶目标序列，并定位于过氧化物酶体上。这种酶在脂肪酸beta氧化途径的辅助步骤中起作用［14］。ECH1在肺癌早期的表达量增高（通过使用纵向的临床前样本，显示了0.763的AUC，灵敏度为60.0%，特异性为89.3%），对肺癌的早期诊断有潜在的意义［15］。

（2）HNRNPA2B1（Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1）是由位于细胞核并编码的琼脂糖蛋白［16］，其基因包含12个外显子，其中包括含有36-核苷酸的编码特殊B1蛋白质的外显子。该基因属于核不均匀的核糖核酸（hnRNPs）的亚族，其编码的这些蛋白质与前体mRNA的处理和加工、转运方面有关及具有明显的核酸结合特性，虽然所有的hnRNPs都存在于细胞核中，但部分可能在细胞核与细胞质之间移动。HNRNPA2B1是一种自身免疫性疾病的自体抗原，如类风湿关节炎、全身性红斑狼疮和混合结缔组织病。当被称为自体抗原时，HNRNPA2B1也 被 称 为 RA33，由 HNRNPA2 和HNRNPB1蛋白质参与包装而新生的mRNA，在细胞质RNA的传输、翻译和稳定中起很重要的作用。HNRNPA2和HNRNPB1也似乎在端粒的维护、细胞增殖和分化、葡萄糖运输中起作用。有研究显示在肺癌中针对HNRNPA2B1的自体抗体表现为0.874，灵敏度为72.2%，特异性为95.5%，表现为与淋巴结转移负相关（rs＝-0.279，P＝0.012），证明其自身抗体的检测有利于肺癌的早期诊断［15］。

（3）BARD1是乳腺癌易感性的主要结合蛋白BRCA1基因产物［18-19］，其结构特点是在细胞内参与很多重要的生命活动，比如与细胞生存、凋亡、DNA的修复等重要活动，肿瘤抑制因子BRCA1相关结构域（BARD1）在针对小鼠的实验中显示能够预防癌症［17］。绑定到BARD1是BRCA1抑制肿瘤活性的必不可少的组成部分，通过其异二聚体E3泛素连接酶活性导致肿瘤抑制［20］。BARD1是通过结合并稳定p53的凋亡诱导剂［21-23］。近年来有研究发现通过BARD1基因的选择性剪接，其表达与在各种癌症进展和预后相关［24-30］。这些缺乏BRCA1相互作用的N端RING结构域的亚型在肿瘤和癌细胞系中大量表达，不但没有肿瘤抑制功能反而具有致癌潜力［24，31-32］。BARD1亚型的过表达与肿瘤进展密切相关，特别是非小细胞肺癌（NSCLC）。因此，对BARD1的自身抗体检测有利于肺癌的早期诊断。

2 自身抗体在肺癌中的检测手段

2.1 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术最初由SMITH［33］于1985年创建，该技术原理是将外源蛋白（癌细胞DNA编码的蛋白）或随机肽库的多肽基因片段插入到噬菌体的外壳蛋白编码区，通过形成融合蛋白并表达于噬菌体表面。过程是通过样本血清与蛋白微球分步孵育以去除非特异性克隆，再经扩增并进行下一轮的筛选。重复“吸附-洗脱-扩增”的过程，目的是达到抗体特异性结合的噬菌体高度富集并进行克隆测序分析。还可以将阳性克隆在硝酸纤维素膜进行验证。目前，噬菌体肽库展示中最常使用的噬菌体是丝状噬菌体家族（filamentous phage family，Ff）的如M13、f1、Fd、ft，以及溶解性噬菌体T7［34］。WU等［35］使用噬菌体T7 cDNA和非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆进行生物筛选，结果鉴定出212个特异噬菌体克隆并制备蛋白芯片，并发现灵敏度和特异性均为91.3%且AUC为0.99的5个联合诊断NSCLC的肿瘤相关抗原（TAA）。优点是所需样本少、灵敏度高，便于自动化、发现未知TAAs等，缺点是操作繁琐、周期长、费用昂贵等。

2.2 重组cDNA表达文库血清学分析

重组 cDNA 表达文库血清学分析技术（serological analysis of recombinant cDNA expression libraries，SEREX）是由SAHIN于1995年建立。该技术的过程是从新鲜组织或细胞中分离提取mRNA，通过λ噬菌体cDNA转染到大肠肝菌内，依次进行转印到硝酸纤维素膜、与含有稀释后的高滴度抗体的血清孵育、酶标二抗的阳性克隆筛选、重复筛选单克隆之后，进行序列测定及生物学研究。目前利用SEREX 技术鉴定癌症已经达到至少2700种TAAs［36］，并被癌症免疫组数据库收录。CHAPMAN等［37］利用SEREX 方法对82例非小细胞肺癌（NSCLC）、22例小细胞肺癌（SCLC）及50例对照血清进行分析，发现一组共4种肺癌潜在的血清学标志物CAGE、NY-ESO-1、MUC1 和 GBU4-5，该 组TAAs针对肺癌的灵敏度达到64% ～92%、特异性92%～100%。优点是所需样本量少，灵敏度高，缺点是实验技术要求高、周期长、无法进行大量标本的筛选。

2.3 血清学蛋白质组分析

血清学蛋白质组分析（serological proteome analysis，SERPA）是一种以蛋白质组学和免疫学原理为理论基础，运用双相电泳、质谱分析方法达到筛选和鉴定TAAs的一种新技术。首先将癌组织或细胞来源的蛋白使用双相电泳方法进行分离，转移到硝酸纤维素膜上，再与肿瘤患者及对照血清、酶标二抗进行孵育、显色，结果显示为免疫阳性蛋白点并分析比较差异点，最后利用质谱技术鉴定确定TAAs。优点是因为SERPA可以分析鉴定翻译后修饰蛋白及蛋白异构体，所以能鉴定更多的TAAs；不用构建cDNA文库，相对比较省时。然而，该技术最大的缺陷是双相电泳重复较差，无法分辨分子量相近的蛋白。应用SERPA方法，FARLOW 等［38］选取117个非小细胞肺癌患者及79个正常对照血清（包括COPD组、正常组）中鉴定出次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）、磷酸甘油酸酯变位酶（PGAM2）、膜联蛋白I（ANXAI）、膜联蛋白II（ANXAII）、HSP70-9B等5个非小细胞肺癌TAAs，该组TAAs诊断非小细胞肺癌的灵敏度为94.8%和特异性为91.1%。

2.4 蛋白芯片技术

蛋白芯片技术为一种可分析蛋白质表达谱、研究蛋白质之间、DNA与蛋白之间、RNA与蛋白之间的相互作用的高通量的蛋白功能分析技术。为筛选鉴定TAAs提供了一种高通量技术平台［39］，该技术最大优点是由于可平行分析大样本且能识别翻译后的修饰蛋白，因此能够筛选鉴定新型的TAAs。可以将纯化或重组蛋白、人工合成肽、肿瘤组织或细胞蛋白等以点的形式系统地负载于固相支持物上，然后与肿瘤阳性血清孵育，筛选出能发生抗原抗体反应的蛋白位点。目前的蛋白芯片主要有玻片、多孔凝胶和微孔板3种固相支持物。这种技术可同时分析多种蛋白，尤其适用于恶性肿瘤的诊断和疫苗研究［40］。缺点是技术要求高、不利于普及。SHAN等［41］应用芯片技术筛选出了一组NY-ESO-1、整合素金属蛋白酶结合蛋白质29（ADAM-29）、XAGE-1和黑素瘤相关抗原C1（MAGEC1）的肺癌自身抗体，并用酶联免疫法诊断的灵敏度为33%、特异性为89%，并且这些抗原并未在正常细胞中发现。

3 多个自身抗体分子的组合在肺癌早期诊断中的应用

早期研究关注发现肺癌单独的自身抗体分子检测灵敏度和特异性都较低，最近的研究关注于多个自身抗体的联合检测以便来提高早期肺癌的检出率。TANG等［42］研究中，首次进行了系统评价和荟萃分析，以评估具有潜在LC的个体血清单一或多重TAAs的诊断价值。研究结果表明，多种自身抗体的单一或不同组合可能具有不同的诊断价值，用于识别来自健康对照或良性疾病、肺癌所有阶段或早期阶段的患者。单一自身抗体显示出低灵敏度，几乎一半的个体自身抗体的诊断灵敏度低于50%。然而，多重自身抗体的组合提供了相对更高的灵敏度（30% ～100%，平均值为70.3%，中位数为77.0%），特异性为43%～97.3%，平均值为86.3%，中位数为90.5%），精度范围为44.1%～97.6%（平均值77.7%，中位数81.2%）。因此，单一自身抗体很少能够以足够高的特异性和灵敏度检测所有LC，而多种标志物组合的检测可以显着提高诊断性能［43-44］。

4 自身抗体对肺癌治疗的应用前景

最近BUSHEY等［45］研究显示根据部分癌症患者并未发生转移，及他们自身的宿主效应为临床的治疗提供了新的策略。研究者之前就报道过抗补充因子CFH的自身抗体与早期肺癌之间的相关性。CFH通过抑制膜攻击复合物的形成来抑制补体介导的细胞毒效应。研究者致力于将这种发现用于癌症的生物学治疗，通过分离肺癌患者的高亲和力的自身抗体相关的B淋巴细胞，DNA表达提取抗补充因子CFH的自身抗体。CFH复合体的共晶体结构显示相对于原有结构发生构象变化。这种重组的CFH抗体能引起过敏反应的激活和释放，促进肿瘤细胞株的CDC，并抑制体内肿瘤的生长。从单一的人类B细胞中分离出来的抗肿瘤抗体，是抗体药物发现的另一种模式。

5 结局和展望

随着肿瘤免疫的不断发展，肿瘤的体液免疫机制揭开了它的面纱，为自身抗体在肺癌的临床应用提供了越来越多的理论基础。作为针对肺癌的自身抗体技术本身具有比其他技术如胸部低剂量计算机断层扫描（1ow-doscomputed tomography，LDCT）技术更早的检测期，相对其他技术来说，可使患者免除大的有创操作，还能结合多种自身抗体的联合检测为患者提供高灵敏度和特异性的早期肺癌诊断；同时也有研究显示未来自身抗体技术不仅用于肺癌的临床早期诊断，也将用于肺癌的早期的治疗。总之我们将来通过不断地对肺癌自身抗体的研究来实现肺癌的早期诊断及早期治疗，为提高肺癌患者的生存率而努力。