2008—2017 年我国部分地区禽源沙门氏菌流行状况及耐药分析

赵建梅，李月华，张青青，赵 格，王 娟，刘 娜，黄秀梅，王君玮，曲志娜

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109）

沙门氏菌是具有公共卫生意义的重要病原菌之一，可引起人和动物的多种疾病。全球每年有9 380 万人因感染沙门氏菌引起腹泻[1]。受沙门氏菌污染的鸡肉制品是人感染沙门氏菌最主要的来源之一[2-3]。肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌是我国禽源沙门氏菌报道最频繁的2 种沙门血清型[4-7]。血清型和耐药性是各国监测和研究沙门氏菌的主要手段。近年来，由于分子分型具有高分辨率和可追溯等优点，也被用于沙门氏菌的监测和研究中。在我国，禽源沙门氏菌的耐药性研究表明耐药情况严重，研究显示对氨苄西林、四环素、萘啶酸等的耐药率高于50%[5-6]。不同来源的沙门氏菌耐药程度有差异，但对氨苄西林都呈现较强的耐药性[8-11]。1983 2014年，英国监测结果显示，禽源鼠伤寒沙门氏菌对氨苄青霉素、四环素、磺胺类药物的耐药呈现上升趋势[1]。为保护公众健康，国内外开展了沙门氏菌耐药基因、毒力基因以及对某些优势血清型的致病、耐药机制的研究[4，12-16]，以及沙门氏菌在环境、动物和人之间关系的研究[16-18]。因此，了解禽中沙门氏菌的流行情况，对控制沙门氏菌在禽养殖过程中的传播，及防控人的沙门氏菌病和降低经济损失具有重要意义。本研究对2008 2017 年中国部分地区的90 株禽源沙门氏菌进行了血清型和MLST 分型鉴定，并用9 大类15 种抗生素对分离菌株进行了药物敏感试验。旨在了解中国部分地区禽源沙门氏菌的血清型和ST 型分布，及其耐药状况，分析它们之间的相关性，为研究沙门氏菌流行病学及其防控措施提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1 .1 菌株 2008—2017 年从山东、河北、湖北、云南、广西、内蒙古、北京、重庆8 个省（自治区、直辖市）采集的禽泄殖腔拭子和盲肠拭子样品中分离的90 株沙门氏菌。大肠杆菌标准株ATCC25922，由中国动物卫生与流行病学中心致病微生物监测室保存。

1.1.2 主要仪器与试剂 PCR 扩增仪（GenMax）、电泳仪（BioRed）、凝胶成像仪（BioRed）、比浊仪（OXOID）、离心机（eppendorf）、分光光度计（上海精科）。沙门氏菌鉴定分型诊断血清套装，为泰国S&A 公司产品；胰蛋白大豆胨培养基、细菌琼脂粉，购自北京陆桥技术有限责任公司；Premix TaqTM，为Takara 公司产品；药敏检测板，为上海星佰生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 血清型鉴定 按照血清凝集方法，对沙门氏菌分离株进行血清型鉴定[19]；根据得到的O、H1 和H2 抗原数据，按照考夫曼-怀特沙门氏菌属抗原表，判定沙门氏菌分离株血清型。

1.2.2 药敏试验 依据美国临床和实验室标准协 会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐，用肉汤稀释法，以大肠杆菌ATCC25922 为质控菌株，对其中71 株菌进行青霉素类（氨苄西林（AMP）、奥格门丁（A/C））、头孢类（头孢噻呋（CEF）、头孢他啶（CAZ））、磺胺类（磺胺异噁唑（SF）、复方新诺明（SXT））、四环素类（四环素（TE）、多西环素（DOX））、氨基糖苷类（庆大霉素（GM）、大观霉素（SPT））、氟喹诺酮类（恩诺沙星（ENR）、氧氟沙 星（OFL））、酰胺醇类（氟苯尼考（FFC））、多肽类（黏菌素 （CL））和喹噁啉类（乙酰甲喹）9 大类15 种抗菌药物的最小抑菌浓度试验。耐3 类及以上药物的为多耐菌株（multi-drug resistant，MDR），本研究中的高耐菌株（high multi-drug resistant，HMDR）为耐5类及以上药物的菌株。

1.2.3 MLST 试验 按照Ryan[20]等的方法扩增分离株的aroC、dnaD、hemD、hisD、purE、sucA和thrA 7 个管家基因，经电泳检测后送擎科生物科技有限公司测序。测序结果用Lasergen MegAlign软件与标准菌CT18 的进行比对、剪切，使其符合MLST 网站的要求。将修正后的序列提交http://enterobase.warwick.ac.uk/species/senterica/allele_st_search 网站，查询管家基因的基因位点编号，由7个管家基因位点编号判断分离株的ST 型。将90株沙门氏菌的7 个管家基因位点编号和ST 型录入BioNumerics 7.6 软件计算相似性系数，构建最小生成树和聚类树。

1.2.4 数据统计分析 用SPSS 软件采用卡方检验、Logistic 回归法处理试验数据，进行显著性和相关性分析。P ＜0.01 为差异极显著，P ＜0.05 为差异显著；P ＞0.05 为差异不显著；对差异显著的血清型、ST 型菌株的耐药性进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 血清型鉴定

90 株沙门氏菌分离株经鉴定分属16 种血清型。其中，54 株S. Enteritidis 为主要血清型，占比60.00%，其次为S. Indiana（9/90，10.00%）、S. Agona（5/90，5.55%）、S. Typhimurium（4/90，4.44%）和S. Gallinarum（3/90，3.33%），另外S. Thompson、S. Tennessee、S. Lomita、S. Meleagridis分 别 为2 株，占 比 为2.22%，S. Augustenbor、S. Chailey、S. Muenster、S. Neftenbach、S.Schwarzengrun、S. Anatum 和S. Kentucky 均为1 株，占比为1.11%。

沙门氏菌株的分离地区中，S. Enteritidis 在8个省份均有分布，且为优势血清型。湖北、内蒙古和重庆分离株较少，血清型为S. Enteritidis；北京、广西、河北和山东分离株血清型比较丰富（表1）。

2.2 耐药性结果及分析

因乙酰甲喹无相应的MIC 判定标准，未统计其耐药数据。71 株菌对氨苄西林和磺胺异噁唑的耐药率最高，分别为78.87%和77.46%；其次为大观霉素、复方新诺明、四环素和多西环素，耐药率均在54%以上，对庆大霉素、恩诺沙星和氧氟沙星的耐药率较低，均低于30%，对头孢他啶的耐药率最低，仅为4.23%（图1）。多重耐药结果显示64 株菌为多耐菌，占90.14%；高耐菌株有26 株，占36.62%。耐药谱为AMP-A/C-CEFGM-SPT-FFC-SF-SXT-ENR-OFL 的 菌 株 有6 株（8.45%），是耐药谱中占比最多的。另外分离到

3 株对检测用药物全敏感的菌株。

2008 2017 年禽源沙门氏菌耐药率变迁的统计结果显示，氨苄西林（P=0.041 4）、大观霉素（P=0.024 1）、复方新诺明（P=0.045 7）和氧氟沙星（P=0.021 3）的耐药率显著上升，阿莫西林/克拉维酸（P=4.23×10-4）、四环素（P=5.52×10-3）、头 孢 他 啶（P=7.38×10-3）耐药率上升极显著，但黏菌素（P=8.22×10-5）耐药率则下降极显著（图2）。多重耐药菌株（P=0.545）和高耐菌株（P=0.416）占比在2008 2017 年间无显著变化（表2）。

表1 我国部分省份禽源沙门氏菌血清型分布 单位：株（%）

图1 2008 2017 年我国部分地区禽源沙门氏菌耐药状况

2.3 MLST 分型结果

90 株禽源沙门氏菌分离株共鉴定出14 个ST 型，其中49株为ST11，占比54.44%，其次 为ST17（9/90，10.00%），ST92（5/90，5.56%），ST26、ST34 和ST13 均 有4 株，各 占4.44%。另外，还有4 株未分型。由图3 可知，按省份为分类单位形成的最小生成树中，只有1 个由55 株菌组成的ST complex，包 括ST11、ST92 和unknown ST2 这3 个ST 型，有2 个管家基因序号的差异，其中的菌株来自河北、山东、北京、广西、内蒙古、云南和重庆7 个省（自治区、直辖市），可以看出我国这些地区的禽源沙门氏菌有同源关系。

图2 2008 2017 年我国部分地区禽源沙门氏菌耐药率变迁

2.4 相关性分析

2.4.1 血清型和ST 型相关性 90 株菌的血清型有16 种，辛普森差异指数（discrimination index，DI）为0.994，ST 型 有14 种，DI 为0.995。S. Enteritidis（n=54）的ST 型主要是ST11（n=38），另 外 还 有ST17（n=4）、ST92（n=4）、ST34（n=3）、ST26（n=2）、ST241（n=1）、ST463（n=1）和1 株未分型菌株。S. Indiana（n=9）的ST 型有ST11（n=5）、ST17（n=3）和1 株未分型菌株；S. Agona（n=5）的ST 型有ST13（n=4）和ST292（n=1）；S. Typhimurium（n=4）的ST型是ST11（n=2）、ST17（n=1）和ST34（n=1）；S. Gallinarum（n=3）的ST 型 有ST11（n=2）和ST92（n=1）；S. Thompson（n=2）的ST 型 是ST26。具体见图4。Logistic 回归法分析显示，ST 型和血清型有一定的相关性（OR=1.289，95%CI：0.467~3.558）。

表2 2008 2017 年禽源沙门氏菌多重耐药情况单位：%（份）

2.4.2 血清型、ST 型和耐药性相关性分析 由表3 可以看出，S. Indiana 对大观霉素的耐药率高于S. Enteritidis，差异显著（P=0.016 3），S. Indiana 对庆大霉素（P=2.93×10-4）、头孢噻呋（P=6.74×10-5）、头孢他啶（P=4.19×10-4）、氟苯尼考（P=8.01×10-5）、恩诺沙星（P=1.36×10-6）、氧氟沙星（P=4.92×10-9）和黏菌素（P=1.03×10-3）的耐药率也高于S. Enteritidis，且差异极显著。S. Indiana（OR=1.445，95%CI：0.108~19.275）比S. Enteritidis（OR=0.376，95%CI：0.038~3.729）更易产生耐药。由此可知，不同血清型对不同种抗菌药存在耐药差异。由图4 可以看出：S. Indiana菌株中，ST17（13种）所耐药物种类多于ST11（≤10种）；ST17 菌株中，S. Indiana（13 种）所耐药物种类多于S. Enteritidis（≤7 种）；且耐头孢他啶的S. Indiana 菌株，其ST 型均为ST17。

图3 我国部分地区禽源沙门氏菌最小生成树

图4 禽源沙门氏菌ST、血清型和耐药谱聚类图

表3 禽源沙门氏菌耐药情况 单位：份（%）

由表4 可知，禽源沙门氏菌S. Enteritidis 多重耐药情况与S. Indiana 相比差异不显著（P=0.339），S. Indiana 高耐菌株高于S. Enteritidis，且差异极显著（P=2.528×10-4）。统计分析表明，禽源沙门氏菌S. Indiana 与S. Enteritidis 相比更易形成高耐菌株药（OR=3.200，95% CI：2.103~4.868）。

表4 禽源沙门氏菌不同血清型和ST 型多重耐药情况单位：%（株）

3 讨论

本研究对2008 2017 年从我国部分地区分离的禽源沙门氏菌分型结果表明，S. Enteritidis 是我国禽沙门氏菌的优势血清型，ST11 是禽源沙门氏菌的流行ST 型。71 株菌的药敏试验结果表明，禽源沙门氏菌对氨苄西林和磺胺异噁唑耐药情况严重，耐药率高于70%，对头孢他啶敏感；统计显示，耐药菌株大多为多重耐药菌株，耐药菌占比最多的耐药谱为AMP-A/C-CEF-GM-SPT-FFC-SF-SXTENR-OFL。

本研究发现，S. Enteritidis 是我国部分地区禽源沙门氏菌的优势血清型，其次为S. Indiana、S. Agona、S. Typhimurium 和S. Gallinarum。 这与文献中我国禽源沙门氏菌血清型分布基本相同[19-24]，与美国禽沙门氏菌主要流行血清型（S.Kentucky、S. Enteritidis 和S. Heidelberg）、欧 洲禽中主要监测的沙门氏菌血清型（S. Enteritidis、S. Typhimurium、S. Virchow、S. Hadar、S. Infantis）有差异[14-15，25]。由此可知，禽类中流行的沙门氏菌优势血清型，除S. Enteritidis 是普遍流行外，其他具有地域性差异。S. Enteritidis 和S. Typhimurim具有广泛宿主性，可以引起人的沙门氏菌病[25-27]。有报道称，美国70%的人沙门氏菌感染是由消费被污染的禽类产品引起的[25]。在我国，也有S.Indiana 在人群中的暴发以及在腹泻病人中分离到S.Agona 的报道[28，29]。这些情况都提示，应该加强禽源沙门氏菌研究，控制禽源沙门氏菌感染人情况的发生。

赵翠等[30]从山东省分离的鸡源和鸭源沙门氏菌ST 型以ST11 为主，刘慧玲等[31]从我国进出口禽源食品中分离的沙门氏菌ST 型主要是ST11。本研究发现ST11 为禽源沙门氏菌分离株的主要ST型，其次为ST17、ST92、ST26、ST34 和ST13。由此可知，我国近年来禽源沙门氏菌MLST 分型中ST11 型是优势型。按省份为分类单位形成的最小生成树显示，只有1 个由大部分分离株形成的ST complex，菌株来源范围广，表明我国不同地区的禽源沙门氏菌存在一定的同源性。研究发现，S. Enteritidis 对应丰富的ST 型，推测沙门氏菌分离株随着时间的变迁，管家基因某些位点产生了突变，或者与菌株的分离宿主、地点有关。

美国2011 年的一份评估报告，将沙门氏菌列入31 种危害人类健康重要病原的第一位，日益严重的耐药性更是加剧了人们对沙门氏菌在公共卫生领域的担忧。2008 2017 年禽源沙门氏菌的耐药性变迁研究表明，菌株对大部分抗生素的耐药性显著升高，这与相关报道基本一致[32]。但本研究发现黏菌素的耐药率下降极显著，可能与近年来农业部门禁止黏菌素用于促动物生长并大力提倡和实施健康养殖等相关。不同省份的耐药率比较显示，多种药物耐药情况差异显著，这应该与各地习惯用药种类相关。值得注意的是，在河北分离株中出现了耐人用第三代头孢他啶的菌株，其与养殖环节不合理用药是否相关需要进一步深入研究。

本研究中S. Enteritidis 和S. Indiana 对试验药物的耐药结果证明，沙门氏菌血清型与耐药性相关，且S. Indiana 耐药情况明显严重。有研究[23]表明，沙门氏菌耐药与血清型密切相关，且从不同宿主分离到的相同血清型的沙门氏菌耐药结果也有差异。Li[33]等也报道S. Indiana 对多种抗生素具有高耐药率，且多重耐药情况严重。刘志杰[34]等对环丙沙星压力下S. Enteritidis、S. Indiana 和S. Typhimurim进行的耐药性研究发现，S. Indiana 更易产生耐药性。从本研究中也可以看出，S. Indiana 对和环丙沙星同属氟喹诺酮类的恩诺沙星和氧氟沙星的耐药率显著高于S. Enteritidis。近年来，也有不同血清型沙门氏菌对抗菌素的耐药情况不同的报道[17，25]。不同ST 型的禽源沙门氏菌除头孢他啶外，对其他抗菌药耐药情况无显著差异。本研究还显示，S.Indiana 菌株中ST17 型的所耐药物种类多于其他型沙门氏菌，且仅S. Indiana 菌株ST17 对头孢他啶耐药，推测S. Indiana 菌株的ST17 比其他型更易产生对头孢菌素的耐药。

4 结论

我国禽源沙门氏菌耐药形势不容乐观，除黏菌素外，对大部分抗生素的耐药率呈上升趋势。禽源沙门氏菌的耐药与其血清型有相关性。S. Enteritidis 是我国禽源沙门氏菌的优势血清型，ST11 为优势ST 型；禽源沙门氏菌的血清型和ST型有一定的相关性，不同地区的禽源沙门氏菌有一定的同源性。