5种病原学检测方法在肺结核病诊断中的应用评价

结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的，以呼吸道传播为主的慢性传染病，是全球所面临的严重的公共卫生问题。结核病可侵犯全身各系统和脏器，其中最常见的为肺结核，肺结核的诊断主要以病原学实验室检查为主，结合临床症状、胸部影像学、免疫学和必要的辅助检查及鉴别诊断，经综合分析作出的诊断[1]。咯血或咳嗽、咳痰大于2周是发现和诊断肺结核的重要线索，检出MTB是结核病病原学诊断最直接有效的证据，主要方法有涂片法、培养法，近年来发展的分子生物学检测技术因其检测时间短，敏感度、特异度高也得到了广泛应用，使结核病的病原学诊断有了突破性的进展。本研究采用涂片法(acid-fast bacilli smear, AFS)、培养法(Lowenstein-Jensen culture, L-J)、环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、多色半巢式荧光定量PCR(Xpert MTB/RIF)及线性探针技术(line probe assay, LPA)同时对258例研究对象的同一份痰标本进行检测，以评价5种病原学检测方法对肺结核病的诊断价值。

1 材料与方法

1.1研究对象 选取2016年1月—2018年3月在陕西省结核病防治研究所和陕西省汉中市第二人民医院就诊的258例肺结核可疑症状者作为研究对象，收集相关临床资料进行回顾性分析。根据肺结核诊断标准(WS288—2017)[1]将研究对象分为肺结核病组和非肺结核病组(无非结核分枝杆菌病患者)。肺结核病组176例：136例临床确诊病例和40例临床诊断病例，其中男性123例，女性53例，平均年龄(42.36±15.28)岁；非肺结核病组82例，男性48例，女性34例，平均年龄(38.64±13.57)岁。

1.2检测方法 同时应用5种病原学检测方法对258例研究对象的同一份痰标本进行检测，其中痰涂片采用直接涂片法进行金胺O荧光染色，进行双人复核镜检；罗氏固体培养采用简单法，培养阳性菌株均采用对硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid, PNB)进行菌种鉴定。罗氏培养基及染色液购自珠海贝索生物技术有限公司，环介导等温扩增检测采用广州迪奥生物科技有限公司的仪器及试剂盒，多色半巢式荧光定量PCR采用美国Cepheid公司的Xpert MTB/RIF检测系统及试剂盒，线性探针检测采用德国Hain Lifescience公司的仪器和耐多药检测试剂盒，各项实验操作均按照《结核病实验室检验规程》[2]中的标准化操作程序进行，如果试验失败均进行二次检测。

1.3统计学分析 采用SPSS 18.0软件和MedCalc 12.7.0软件进行统计学分析。以临床诊断结果分组计算5种病原学检测方法的阳性率。以培养和鉴定为金标准，计算4种检测方法的灵敏度(sensitivity, Se)、特异度(specificity, Sp)、阳性预测值(positive predictive value, PPV)、阴性预测值(negative predictive value, NPV)及95%置信区间(95% confidence interval, 95%CI)；率之间的比较采用χ2检验，4种方法与培养和鉴定法进行一致性检验(Kappa检验)，K<0.4为一致性较差，0.4≤K<0.75为一致性较好，K≥0.75为一致性极好；以受试者工作特征(receiver operation characteristic, ROC)曲线评价4种病原学检测方法的诊断价值，ROC曲线下面积(area under the curve, AUC)的比较采用Z检验，ROC曲线下面积取值范围为0≤A≤1，A≤0.5时诊断试验无诊断价值，0.50.9时诊断价值较高。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.15种病原学检测方法的阳性率比较 103株培养阳性分枝杆菌经PNB菌种鉴定均为结核分枝杆菌。在176例肺结核病患者中，LAMP(73.30%)、Xpert MTB/RIF(77.27%)、LPA(70.45%)的阳性率均显著高于AFS(46.02%)和L-J(58.52%)，L-J的阳性率显著高于AFS，差异均有统计学意义(P<0.05)。AFS、L-J、LAMP、Xpert MTB/RIF、LPA诊断肺结核病的漏诊率依次为53.98%、41.48%、26.70、22.73%、29.55%，误诊率依次为0.00%、0.00%、4.88%、2.44%、1.22%。见表1。

表1 5种病原学检测方法的阳性率

Tab.1 Positive rates of five etiological methods

检测方法肺结核病组(n=176)非肺结核病组(n=82)阳性例数阳性率/%阳性例数阳性率/%AFS8146.0200.00L-J10358.5200.00LAMP12973.3044.88XpertMTB/RIF13677.2722.44LPA12470.4511.22

2.14种病原学检测方法的效能比较 以培养和鉴定为金标准，LAMP(93.20%)、Xpert MTB/RIF(97.09%)、LPA(92.23%)的灵敏度均高于AFS(68.93%)；AFS的特异度(93.55%)均高于LAMP(74.84%)、Xpert MTB/RIF(75.48%)、LPA(83.23%)；AFS的阳性预测值(87.65%)均高于LAMP(71.11%)、Xpert MTB/RIF(72.46%)；LAMP(94.31%)、Xpert MTB/RIF(97.50%)、LPA(94.16%)的阴性预测值均高于AFS(81.92%)。差异均有统计学意义(P<0.05)。AFS、LAMP、Xpert MTB/RIF、LPA与培养和鉴定法进行Kappa检验，Kappa值依次为0.65、0.65、0.69、0.73，均表现出较好一致性。见表2。

表2 4种病原学检测方法的检测效能比较

Tab.2 Predictive value of 4 etiological detection methods

检测方法检测结果培养和鉴定(n=258)+-Se/%(95%CI)Sp/%(95%CI)PPV/%(95%CI)NPV/%(95%CI)AFS+711068.9393.5587.6581.92-32145(59.99～77.87)(89.68～97.42)(70.48～94.82)(76.23～87.61)LAMP+963993.2074.8471.1194.31-7116(88.34～98.06)(68.01～81.67)(63.46～78.76)(90.40～98.22)XpertMTB/RIF+1003897.0975.4872.4697.50-3117(92.84～99.43)(68.71～82.25)(65.01～79.91)(93.96～99.52)LPA+952692.2383.2378.5194.16-8129(86.99～97.47)(77.31～89.15)(71.19～85.83)(90.23～98.09)

2.24种病原学检测方法的ROC曲线及分析结果 以培养阳性且鉴定为结核分枝杆菌为分类变量，以其余4种病原学检测方法为检验变量，4种方法的灵敏度和特异度绘制的ROC曲线见图1， AUC由大到小依次为LPA(0.877)>Xpert MTB/RIF(0.863)>LAMP(0.840)>AFS(0.812)，4种方法的诊断价值均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

图1 4种病原学检测方法的ROC曲线Fig.1 ROC of 4 etiological detection methods

表3 4种病原学检测方法ROC曲线的AUC分析结果

Tab.3 AUC analysis of 4 etiological detection methods

检测方法AUCS.E95%CIZ值P值AFS0.8120.02500.759～0.85812.517<0.0001LAMP0.8400.02150.790～0.88315.846<0.0001XpertMTB/RIF0.8630.01920.815～0.90218.871<0.0001LPA0.8770.02010.831～0.91518.813<0.0001

表4 4种病原学检测方法之间诊断价值的比较

Tab.4 Comparison of the diagnostic value of 4 pathogenic methods

检测方法比较AUC的差异S.E95%CIZPAFS-LAMP0.02780.02850.0281～0.08370.9750.3295AFS-XpertMTB/RIF0.05050.02750.0035～0.10401.8340.0667AFS-LPA0.06490.02690.0121～0.11802.4090.0160LAMP-XpertMTB/RIF0.02260.01700.0108～0.05601.3290.1839LAMP-LPA0.03710.02030.0026～0.07681.8290.0674XpertMTB/RIF-LPA0.01440.01830.0214～0.05031.7900.4294

2.34种病原学检测方法之间诊断价值的比较 通过对4种病原学检测方法之间的相互比较，涂片法的AUC小于LPA的AUC，AUC差异有统计学意义(P<0.05)；其它检测方法的AUC之间的比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。表4。

3 讨 论

临床对于某一种传染性疾病的确诊，必须要从患者身上获得病原学证据，“十三五”全国结核病防治规划要求肺结核患者病原学阳性率达到50%[3]，要实现这个目标必须加强结核病实验室能力建设，从以涂片镜检发现传染性肺结核病患者为重点扩展到细菌学及分子生物学诊断。培养法可作为疗效评估指标，被认为是诊断肺结核病的“金标准”，阳性表示有分枝杆菌生长，不能排除非结核分枝杆菌感染，确诊还需依赖于菌种鉴定[4]。涂片阳性表示查到抗酸菌，无法判断活性，本研究结果显示：与罗氏培养法相比，AFS的灵敏度为68.93%，与姜广路[5]报道的灵敏度67.3%接近，低于宋媛媛[6]报道的灵敏度84.8%，可能与不同实验室条件、人员及痰标本性状的差异有关。ROC曲线分析结果表现出较高的诊断价值(AUC=0.812)，与之前报道结论相同。

近年来因典型结核病症状就诊患者在逐渐减少，多数可疑就诊者痰标本量很少，给实验室和临床医生诊断带来很大难度，仅凭这两种病原学检测方法已经不能满足临床诊断的时效需求。随着对结核分枝杆菌全基因组的解析，分子生物学技术因检测时间短、灵敏度高而被用于肺结核病的早期诊断，并已纳入了肺结核诊断标准中[1]，提高了病原学的诊断效率。阳性结果表示查到结核分枝杆菌的DNA，但无法判断其活性，可用于结核病的诊断和鉴别诊断，对于诊断疗效判定并非理想。

国内外多项研究表明，以罗氏培养法作为金标准，LAMP的灵敏度在77%～100%之间，特异度在85%～99%之间[7]，这种差别可能因不同的研究所采用的LAMP试剂盒品牌及设备不同有关，本研究LAMP的灵敏度为93.20%，特异度为74.84%，与国内于霞[8]报道灵敏度为96.19%，特异度为76.87%相较为接近，低于欧喜超[9]报道的特异度96.86%。Xpert MTB/RIF的灵敏度为97.09%，特异度为75.48%，与国内外报道的灵敏度95.0%[10]和96.0%[11]相接近，特异度低于国外报道的98.6%[11]。国内以评价LPA检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的研究居多，而评价LPA检测结核分枝杆菌效果的研究相对较少，2014年，在南非、巴西、秘鲁结核病实验室的多中心研究表明，LPA检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度分别为82.3%和100%[12]；尼日利亚报道LPA的灵敏度和特异度均为95%[13]，南非报道LPA的灵敏度为49.33%，特异度为99.19%[14]；印度的研究表明LPA的灵敏度为81.5%，特异度为87.5%[15]。本研究LPA的灵敏度和特异度分别92.23%和83.23%，与国外研究结果相比特异度相对较低，差异产生的原因可能由于国外研究均将液体培养或将罗氏培养+液体培养联合作为金标准，从而进一步提高了金标准的灵敏度。经查阅资料进一步分析发现16例涂片、培养均为阴性的临床诊断病例均有不同程度的治疗史，影像学无异常，其中14例分子生物学检测结果为阳性，其中LAMP 13例、Xpert 10例、LPA 8例。在此类患者标本中可能存在死亡的结核菌、持留菌或结核菌含量低于涂片法和培养法的检出限，导致分子生物学检测方法出现较高的假阳性率，使特异度降低。罗氏培养法作为金标准也存在灵敏度较低的劣势[16]，据报道涂片法和培养法的检出极限分别为5 000～10 000菌/mL和100菌/mL以上[3]，在实际操作中易受人为等各种因素影响，检出限会进一步提高，而LAMP、Xpert MTB/RIF、LPA的检出极限分别为101CFU/mL[7]、131CFU/mL[17]、10 000 CFU/mL[15]，因此涂片、培养阴性并不代表标本中无结核分枝杆菌，可能由于细菌数量级低于检出极限导致，所以分子生物学方法对菌阴肺结核的检出有可能影响结果的评判。

将AFS、LAMP、Xpert MTB/RIF、LPA分别与L-J进行Kappa检验，结果显示4种方法均表现出较好的一致性，通过分析ROC曲线发现，AFS、LAMP、Xpert MTB/RIF、LPA的AUC值均大于0.7，表明4种方法对于肺结核病的诊断均具有较好的诊断效果。4种检测方法之间的比较显示：灵敏度以AFS最低，Xpert MTB/RIF最高，特异度以AFS最高，LAMP最低。仅LPA的AUC显著高于涂片法的AUC，表明LPA的综合诊断价值优于涂片法，3种分子生物学检测方法的综合诊断价值相当。在肺结核组中LAMP、Xpert MTB/RIF、LPA的阳性率均显著高于AFS和L-J，在一定程度表明，LAMP、Xpert MTB/RIF、LPA在早期发现肺结核病传染源方面价值优于AFS和L-J；3种分子检测方法中以Xpert MTB/RIF的阳性率最高，可能与不同方法设计原理有关，此外，Xpert MTB/RIF是集DNA提取、PCR扩增、产物分析于一体的封闭式检测系统，受外界因素影响较少，而LAMP和LPA在DNA提取、PCR扩增过程均有不同的人为操作，以及LPA的条带显色不清楚也会给结果带来一定的偏倚。

综上所述，涂片法当天可报告结果，灵敏度较低，特异度较好；培养法作为金标准方法，需要4～8周才可得出结果，这两种方法可有效降低误诊率。LAMP、Xpert MTB/RIF、LPA的检测时间分别约为2h、2 h、6 h，灵敏度较高，可降低漏诊率，其中对于检测阳性结果，Xpert MTB/RIF可同时检测利福平灵敏性，而LPA可同时检测利福平和异烟肼的灵敏性[18]；此外，分子生物学检测技术容易发生污染造成假阳性或标本中存在抑制PCR反应物质产生假阴性。在临床应根据每种检测方法的特点，联合不同的检测方法进行诊断，并结合患者的病情，客观、合理的解读检验结果，进而有效降低诊断的漏诊率和误诊率，实现精确、特异、合理、快速的诊断，为拟定临床治疗方案提供依据。

利益冲突：无

引用本文格式：杨健，张天华，鲜小萍，等.5种病原学检测方法在肺结核病诊断中的应用评价[J].中国人兽共患病学报，2019，35(7)：672-676. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.086