和田羊KRT31和KRT85基因遗传多态性及其与羊毛性状关联性分析

赵 雄，黄李勇，李 彬，李志强，依明·苏来曼

（新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052）

角蛋白家族是与羊毛纤维相关的主要基因，其中角蛋白的表达最为丰富，动物表皮中的蛋白质大多数为角蛋白，且它是构成羊毛纤维的主要蛋白[1]。角蛋白家族包括由多基因家族编码的最少有30种蛋白质分子[2]。

羊毛具有复杂的组织结构，羊毛纤维组成有角蛋白中间丝和角蛋白辅助蛋白，其中KRT31和KRT85基因属于角蛋白中间丝。羊毛质量会受到编码这些蛋白质的基因影响，所以可作为育种的候选基因[3]。

应诗家等[4]采用PCR技术，检测了5个群体，角蛋白中间丝I型基因第1外显子的遗传多态性，并与绵羊羊毛性状相关性分析。得出在480bp处5个绵羊群体中均有2个等位基因突变，但是位点与羊毛纤维直径不相关。杜文敬等[5]以绵羊基因组DNA为模板克隆获得了绵羊中间丝蛋白基因，采用脂质体法转染传代培养的绵羊皮肤成纤维细胞，在绵羊成纤维细胞中K2.10启动子具有表达活性。晏华春[6]对和田羊角蛋白家族5个候选基因遗传多态性进行了研究，得出KRT31基因EE基因型和EF、FF基因型差异显著，FF、EF基因型差异极显著；与羊毛细度进行关联性分析，得出三个基因型差异均不显著。张敏[7]对512只阿勒泰羊个体毛绒样品进行品质性状测定，并采PCR-SSC和DNA直接测序技术，研究了在阿勒泰羊中的KRT36基因的遗传多态性，得出KRT36-2中三种基因型均对阿勒泰羊绒毛纤维直径等九个性状有极显著影响(P＜0.01)，所以可以作为以上品质性状标记辅助选择的有效 DNA标记。狄江[8]研究发现KRT38是羊毛、羊绒的主要结构成分，该基因可作为候选基因进行下一步研究。

本试验选择和田羊作为试验材料，采用PCR-SSCP和DNA测序等技术对和田羊KRT31和KRT85基因进行多态性检测，并和其对应的羊毛性状进行关联性分析，为了寻找出和羊毛性状有关的基因，从而为今后和田羊的育种工作和改善羊毛性状提供科学依据，以及增加农牧民的经济收入，改善生活。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样本

本试验材料是和田羊400只，其年龄1～1.5周岁，个体无明显差异，健康无病。样品为血样5 mL。

1.1.2试验药品

30%非变性聚丙烯酰胺，C2H6O，70%C2H6O，Tris平衡酚， 核酸提取液，Taq PCR MasterMix，Loading Buffer，DL2000，双蒸水，CH2O，T10E10，T10E1，琼脂糖粉，AgNO3，NaOH 等。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取

方法为：酚-氯仿抽提法。将血液中和田羊基因组DNA，溶于T10E1溶液中，放置于-20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 引物的设计与合成

参考绵羊KRT31和KRT85基因序列，利用Premier5.0软件设计引物，引物序列见表1。在生物公司进行引物合成。

表1 引物信息

1.2.3 PCR扩增体系与反应条件（见表2）

表2 PCR 20 μL反应体系

1.2.4 PCR-SSCP检测

吸取10 μL PCR产物加入7μL变性剂98℃变性10 min，然后冰浴30 min，用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，电泳300 V，50 mA空跑30 min，预跑10 min，180 V电泳15 h后用硝酸银溶液染色30 min，氢氧化钠和甲醛溶液显色，显色后置于凝胶成像仪中成像、分析、判定各种基因型，并对试验结果进行保存。

1.2.5 羊毛伸直长度的测定

(1)将所抽取的毛样整齐的排在黑绒板上，剥去与此相连的其他毛样。(2)用载玻片压住毛样的一侧，然后用镊子从另一侧随机抽取毛样，直到弯曲度消失。(3)记录测量毛样的伸直长度，精确到1mm。（参考羊毛纤维长度试验方法GB/T 6501-1986国家标准）

1.2.6 显微投影仪法测定羊毛细度

（1）随机取出10根以上的毛样，切成长度为0.4～0.7 mm碎片。（2）加入适量的甘油，然后将一些样品放在载玻片上。（3）把物镜测微尺轻放到显微镜载物台上，使其投影能够呈现在屏幕上来看物镜测微尺每一小格的长度大小。把投影倍数调制放大到原来的500倍测量羊毛直径。调节投影屏幕的距离，然后把物镜测微尺取下，把带有试样的载玻片放在载物台上，并用楔尺来测量样品羊毛纤维的直径。（4）用楔尺逐个测量每根纤维的直径并按顺序测量。相应地记录每个测量的纤维直径。（5）重复制备三个羊毛样品，并选择其中两个进行测量。每个片子的测量条数不小于400，结果使用算术平均值。（参考羊毛纤维直径试验方法-投影显微镜法GB/T 10685-1989国家标准）

2 结果与分析

2.1 提取DNA结果检测

图1是在1%的琼脂糖凝胶上将提取的DNA进行点样，得出的结果是基因组DNA各泳道条带清晰且无拖尾现象，可进行后续试验。

图1 和田羊DNA检测结果

2.2 KRT31基因

2.2.1 KRT31基因PCR产物检测结果

用2%浓度的琼脂糖凝胶对所得产物进行检测，结果如图2所示，所得目的片段清晰明亮，条带单一且无杂带，片段大小在162bp与预期想的扩增的片段大小接近，所以PCR产物可用于后续的SSCP试验。

图2 KRT31的PCR检测结果

2.2.2 KRT31基因的PCR-SSCP检测结果

KRT31基因的PCR扩增产物变性后用12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶检测，电泳6 h，检测结果如图3所示，结果出现了两种不同类型的条带，分别定义为GG型和GA型。

图3 KRT31基因的PCR-SSCP检测结果

2.2.3 KRT31基因的测序结果

选择KRT31基因扩增的不同类型PCR产物各2个样品送生物测序，测序结果与Genbank上发表的绵羊KRT31基因序列进行多序列比较，结果显示KRT31基因在外显子3的174 bp处存在A碱基的缺失，通过氨基酸序列分析发现，该基因A碱基的缺失，使色氨酸缺失，结果如图4。

图4 KRT31基因的测序结果

2.2.4 KRT31基因的基因频率和基因型频率

由表3可知，在检测的和田羊群体中，KRT31基因存在2种基因型：GG和GA型，基因频率分别为0.68和0.32。G等位基因频率为0.84，A等位基因频率为0.16。等位基因G为优势等位基因。经卡方检验，KRT31基因在和田羊群体中处于Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。

表3 KRT31基因的基因型频率和等位基因频率

2.2.5 KRT31基因的遗传参数值

从表4可以看出，和田羊KRT31基因纯合度为0.7312，基因杂合度为0.2688，有效等位基因为1.368，多态信息含量为0.233。和田羊KRT31基因多态位点属于低度多态（PIC<0.25）。

表4 KRT31基因的基因纯合度、杂合度、有效等位基因数及多态信息含量

2.2.6 KRT31基因多态性与羊毛性状的关联分析

KRT31基因的不同基因型与羊毛性状关联性分析：从表5看出，GG基因型和GA基因型的羊毛长度差异显著（P<0.05），但是羊毛细度差异不显著（P>0.05）。

表5 不同基因型与羊毛性状关联分析结果

2.3 KRT85基因

2.3.1 KRT85基因PCR产物检测结果

用2%浓度的琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测，结果如图5所示，所得目的片段清晰明亮，条带单一且无杂带，片段大小在427bp与预期想的扩增的片段大小接近，所以PCR产物可用于后续的SSCP试验。

图5 KRT85的PCR检测结果

2.3.2 KRT85基因的PCR-SSCP检测结果

KRT85基因的PCR扩增产物变性后用12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶检测，电泳16 h，检测结果如图6所示，结果出现了两种不同类型的条带，分别定义为AA型和AB型。

图6 KRT85基因的PCR-SSCP检测结果

2.3.3 KRT85基因的测序结果

选择KRT85基因扩增的不同类型PCR产物各2个样品送生物公司测序，测序结果与Genbank上发表的绵羊KRT85基因序列进行多序列比较，结果显示KRT85基因在外显子2的204 bp处存在A到G的突变，可以记作A204G。通过图7和8运用MEGA7软件对氨基酸序列进行比较分析，KRT85基因上A204G处的突变并未使氨基酸的编码发生改变，此位点突变为同义突变。

图7 KRT85基因的测序结果

图8 各基因型测序峰图

2.3.4 KRT85基因的基因频率和基因型频率

由表6可知，在检测的和田羊群体中，KRT85基因存在2种基因型：AA和AB型，基因频率分别为0.33和0.67。A等位基因频率为0.67，B等位基因频率为0.33。等位基因A为优势等位基因。经卡方检验，KRT85基因在和田羊群体中处于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表6 KRT85基因的基因型频率和等位基因频率

2.3.5 KRT85基因的遗传参数值

从表7可以看出，和田羊KRT85基因纯合度为0.556，基因杂合度为0.444，有效等位基因为1.8，多态信息含量为0.346。和田羊KRT85基因多态位点属于中度多态（0.25

表7 KRT85基因的遗传参数

2.3.6 和田羊KRT85基因多态性与羊毛长度的关联分析

KRT85基因的不同基因型与羊毛性状关联性分析：分析表8得出，AA和AB 2种基因型的羊毛长度及细度差异均不显著（P>0.05）。

表8 不同基因型与羊毛性状关联分析结果

3 讨 论

本研究中，多态信息含量分别为0.233和0.346。和田羊KRT31基因多态位点属于低度多态 （PIC＜0.25），而KRT85基因多态位点属于中度多态（0.25＜PIC＜0.5），表明在这两个位点和田羊群体遗传变异水平低，变异程度差异不大。同时也表明在今后和田羊培育中可以加强人工选择力度，为新疆和田羊分子育种工作打下理论基础。

晏华春等[9]以400只和田羊血样为材料，研究了和田羊KRT31基因的多态性，并与羊毛细度进行关联性分析，结果是和田羊KRT31基因中存在3种基因型：EE、EF和FF，但三种基因型之间的羊毛细度差异均不显著（P＞0.05）。张露[10]以600只沂蒙长毛兔育种群为试验材料，利用混池测序对其进行多态性检测，得出KRT31基因的位点-524对粗毛纤维直径有显著影响（P＜0.05）。马依拉·吐尔逊[11]以中国美利奴羊为试验材料，研究了 KRT27、KRT31、KRT36、KRT38、KRT81和 KRT85基因，得出KRT31基因 Q1位点存在CC、CD基因型，该基因为中度多态，关联分析发现与羊毛直径差异显著（P＜0.05）。

有关于KRT基因及其多态性的研究主要集中在人与家畜等领域。有人发现人、牛、绵羊KRT基因的系统发育具有高度的一致性，且序列保守性较强[12]。迪丽娜热·阿布都热合曼[13]以中国美利奴羊为试验材料，运用PCR-SSCP技术研究了KRT85基因，得出KRT85-1不同基因型对中国美利奴羊羊毛弯曲数有显著影响（P＜0.05）。

4 结 论

本试验采用PCR-SSCP技术和DNA测序技术，对新疆和田羊KRT31和KRT85基因的遗传多态性进行研究。结果显示，新疆和田羊在KRT31基因的第3外显子174bp区域存在A碱基的缺失，共产生2种基因型：GG和GA型，关联分析发现GG基因型和GA基因型的羊毛长度显著（P＜0.05）。在KRT85基因的第2外显子204bp区域存在A到G的突变，共产生2种基因型：AA和AB型，关联分析AA和AB 2种基因型的羊毛长度及细度差异均不显著（P＞0.05）。则KRT31基因与羊毛长度性状相关，为今后发展羊毛资源与改善羊毛品质提供科学依据，而KRT85基因应加大样本含量或在其它外显子区域进行研究。