绵羊鲜精低温保存及应用技术研究

肖广庆，刘新伟，李恒帅，侯玉武（河南省洛阳市畜牧良种繁育推广中心，河南 洛阳 471013）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验器材

相差显微镜（OLYMPUS,日本），密度仪（IMV，法国），水浴锅，数控冰箱，泡沫盒，度计,假阴道，保定架，输精枪。

1.1.2 鲜精及实验动物来源

供精羊为洛阳市畜牧良种繁育推广中心羊场的4头杜泊羊，4头澳洲白和3头纯种萨福克羊种公羊。实验羊来自新安县三森牧业有限公司湖羊。

1.1.3 鲜精低温保存稀释液配方：

短期保存液(3 d，以下称 D液)：Tris 3.18 g，果糖0.68 g，葡萄糖0.38 g，柠檬酸1.88 g。加蒸馏水100 mL，加卵黄20 mL。用前还要在已配好的稀释液里每毫升加青霉素和连霉素各1000国际单位。

长期保存液（13 d，以下称C液）：D液每100 mL加入防腐剂 （食品添加剂）0.05 g，VE 5 mg，EDTA 0.1 g。

1.2 实验分组及方法

1.2.1 实验一：绵羊精液短期（3 d）保存活力衰减实验

实验目的：通过该实验了解鲜精稀释后存放温度对活力的影响，找出最佳存放及运输保存方式。实验方法：羊采精后马上用D稀释液稀释，然后分别放在室温（常温空调（15℃～25℃）、冰箱冷藏（0℃～4℃），泡沫盒放冰袋（0℃～8℃））保存，观察活力情况。为减少原精活力差别，采用同只羊精液稀释后三等分标注A/B/C分别存放。

1.2.2 实验二：不同品种绵羊精液相同保存状态活力衰减实验

实验目的：通过该实验了解羊鲜精用相同稀释液稀释后在相同保存状态下，不同品种间鲜精保存活力影响差异。实验方法：不同品种羊精液用同种稀释液稀释，放置冰箱冷藏（0℃～4℃）保存，观察活力情况。

1.2.3 实验三：长期保存稀释液稀释存放时间实验

实验目的：观察长效稀释液在低温存放状态下最长保存时间及品种间差异性。实验方法：不同品种绵羊精液用C稀释液稀释后放置在冰箱冷藏（0℃～4℃）保存，观察活力衰减及品种间差异。

1.2.4 实验四：绵羊鲜精低温保存不同存放时间受胎率实验。

实验目的：鲜精低温保存目的在于其配种后的受精能力是否受影响，通过该实验了解羊鲜精低温保存时间对受胎率的影响，从而为实际生产提供依据。实验方法：在新安县三森牧业有限公司羊场挑选90日龄母羊，经同期发情处理，用低温存放1 d、2 d、3 d的鲜精输精，采用常规阴道（子宫颈口）输精方式，40 d后B超检查受胎情况。

1.2.5 保存状态及精液检测

冰箱存放：鲜精稀释后，把盛有精液的集精杯放入试管架浸泡水中再放入冰箱（达到缓慢降温），冰箱温度用温度计校准后使用。冰袋泡沫盒保存：用壁厚2～3 cm泡沫盒，体积适中，冰袋与精液透气隔开，密封保存。室温保存：用泡沫盒密封保存。空调温度设置25℃。所有保存方式用温度计测试温度并记录。活力观察：用相差显微镜，在400倍显微镜下评定鲜精活力，显微镜载物台的温度应保持在38℃～40℃，共选取3个以上视野评估。每4 h观察一次。密度：取原精10 μL，用0.9%生理盐水稀释400倍，放入密度仪中直接读取。稀释倍数：均按1：3倍稀释。

2 结果与分析

2.1 实验一

绵羊精液短期（3 d）保存活力衰减实验。2018年3月16日选取洛阳市畜牧良种繁育推广中心种羊场杜泊羊DB16102采精，连续两次采精，射精量2.4 mL，等分3份，每份0.8 mL，原精活力91.56%±0.23%，密度36.23±0.5亿，用D稀释液1：3倍稀释后保存如表1。

表1 不同状态鲜精保存活力情况表

结论：同一只羊，相同稀释液及稀释比例，在冰箱或冰袋存放状态下活力差异不显著。3 d活力衰减分别为3.5%、4.4%，经10次重复试验，活力衰减在5%以内，冰箱或冰袋存放差异不显著（P＞0.05）。常温存放（最好2 h之内用完，适合现配现用），最长8 h，最短6 h，与原精活力有关，原精活力好存放时间长，原精活力差存放时间短。

2.2 实验二

不同品种绵羊精液相同保存状态活力衰减实验。2018年3月22日，挑选洛阳市畜牧良种繁育推广中心种羊场杜粕羊、澳洲白、萨福特原精活力较好（80%）以上的，用D稀释液1：3倍稀释后分品种混合,放冰箱冷藏（0℃～4℃）保存，见表 2。

表2 不同品种绵羊冰箱冷藏保存3 d活力实验

结论：品种间相同稀释液冰箱冷藏存放，3 d活力衰减分别是4.2%、3.6%、3.6%，品种间活力衰减差异不显著(P＞0.05），均在 5%以内。

2.3 实验三

长期保存稀释液稀释存放时间实验。2018年8月22日，把同品种羊精液（80%）以上活力用C稀释液1：3倍稀释后混合，冰箱冷藏（0℃～4℃）保存，结果见表3。

表3 不同品种绵羊鲜精冷藏状态下存放时间实验

结论：在冷藏条件下，长效稀释液最长可保存13 d（活力达到0.35以上），第14 d快速衰竭至0。在当今物流条件下，由于公羊站3 d之内供精可辐射国内任何以地区，所以，长效保存仅限于理论研究。可为偏远地区如西藏、新疆等地提供理论支持。

2.4 实验四

绵羊鲜精低温保存不同存放时间受胎率实验。2018年8月在新安县三森牧业有限公司选择舍饲湖羊待配母羊90只,中等膘情，30只一圈分别为A、B、C三圈。分别用1 d、2 d、3 d存放鲜精配种。

把A、B、C三圈羊分别于 2018年8月 15、16、17日上午放置进口海绵栓，第13 d（27日/28日/29日）上午撤栓打针，每只注射300单位孕马血清，第15 d（29/30/31日）上午输精。第14 d（8月28日）上午采精，用D稀释液1：3稀释后放冰箱冷藏保存。输精量每只母羊输鲜0.2 mL一次，2次输精。90头份共需鲜精36 mL（30头份12 mL一试管A/B/C分开保存）。输精时取出鲜精33℃水浴存放。具体情况见表4。

表4 绵羊鲜精保存时间长短受胎率实验

由表2可见，精液低温保存活力衰减较低，但受胎率差异显著(P＜0.05）。鲜精冷藏24 h受胎率＞鲜精冷藏48 h＞鲜精冷藏72 h。其中鲜精冷藏1 d与第2 d受胎率减少6.7%，存在显著差异（P＜0.05）；第1 d与第3 d受胎率减少16.7%，存在极显著差异（P＜0.01）。说明精液低温保存时间对受胎率有一定的影响，尽量缩短保存时间。用低温保存后的鲜精做人工输精，虽然返情率较高,但排除人工授精和同期发情不利因素，总体看效果还是令人满意的。

3 讨 论

近年来我国养羊业发展迅速，规模养殖蓬勃发展，但羊人工授精技术相对滞后。尤其是在我国绵羊冻精生产与应用技术还不十分成熟的情况下,广泛推广羊鲜精低温保存技术，为羊人工授精技术推广、种公羊站建设推广提供技术支撑，从而提高优秀种公羊利用效率，降低种羊场饲养种公羊费用，提高良种覆盖率及改良效果。

羊人工授精受胎率受精液活力、人工授精技术、羊发情鉴定技术、羊同期发情技术、饲养管理技术等影响，需要逐步进行规范研究，制定相关技术规范，才能实现稳定提高的目的。