马疱疹病毒1型ORF30基因原核表达载体的构建

加尔肯，库来汗·巴依多拉，冉多良，艾海提·亚森，布力布力汗，刘建华*

（1.新疆农业大学动物医学学院，家畜传染病实验室，乌鲁木齐 830052；2.新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所，乌鲁木齐 830063；3.新疆畜牧科学院，乌鲁木齐 830011)

马鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis，ER)是一种引起妊娠马流产和呼吸道疾病为特征的高度接触性传染病[1]。马鼻肺炎病原体为两种疱疹病毒，马疱疹病毒1型（EHV-1）和4型（EHV-4），表现为单克隆抗体对抗原的反应不同，核苷酸序列的同源为55%-84%，氨基酸序列的同源性55%-96%，基因长度分别为150.2kb和145.6kb。马鼻肺炎首先由Dimock和Adwards于1933年在美国的肯塔基州发现[2]。1954年12月首次在我国察北牧场发现本病[3]。杨永龙[4]等从流产胎儿中分离出EHV-1，证实了该病在新疆地区的存在。EHV-1在新疆以高感染率形式出现，如果不深入调查研究，不采取严格的防治措施，将造成更大的危害[5]。

马疱疹病毒（Equine herpes virus，EHV）属于疱疹病毒科、疱疹病毒α亚科、水痘病毒属。EHV-1是由双股线型DNA分子及囊膜构成的120～200nm病毒粒子[6]，成熟的马疱疹病毒带有囊膜呈球形或不规的球形，囊膜内是直径15～200 nm的20面体核衣壳，由162个壳粒组成。在超薄切片的标本上可见病毒核心呈十字形现象，这一现象只在几种少数病毒中可见，其他疱疹病毒并无此特征，因此具有一定的鉴别意义。

EHV-1主要引起孕马病毒性流产，轻度呼吸道症状、马驹死亡、脑脊髓炎等神经性症状。EHV-1所引起的神经系统疾病又称为马疱疹病毒性脑脊髓病（Equine herpes myeloencephalopathy，EHM）近年来世界上由EHV-1引起的神经系统症状有上升趋势，其主要表现为共济失调，后肢和腰部麻痹，甚至瘫痪死亡。

表1 引物和序列

EHV-1病毒ORF30基因2254点突变与其神经性密切相关。流产型株：腺嘌呤（A）—AAU和AAC序列的核苷酸，产生天冬酰胺（N752）。神经型毒株：鸟嘌呤（G）—GAU和GAC序列的一种核苷酸，能产生天冬氨酸（D752）。天冬氨酸（D752）取代天冬酰胺（N752）位置，一个点的基因突变，产生马疱疹病毒的流产株变为神经性毒株[7]。

为了鉴定新疆株EHV-1-XJ2015株的表型特征，本研究对EHV-1-XJ2015毒株ORF30基因进行克隆，并对原核表达载体分析，PCR技术扩增EHV-1-XJ2015分离株ORF30基因相应区域[8]，连接至克隆载体pMD19-T-ORF30，对重组质粒pET-28a(+)-ORF30进行PCR扩增和双酶切鉴定。为马鼻肺炎预防和疫苗的研究提供微小理论依据，从而以减少养马产业的经济损失。

1 材 料

1.1 毒株

EHV-1-XJ2015毒株由新疆农业大学动物医学学院传染病实验室保存。

1.2 主要试剂

pMD19-T、pET-28a(+)、两种双切酶均购自Takara宝生物（大连）工程有限公司；DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自Omega公司均购自DNA Marker；DL1000/10000DNA Marker购自北京康为世纪生物科技有限公司

2 方 法

2.1 引物的设计与合成

根据GenBank中已发表的EHV-1病毒ORF30基因序列，用DNAStar软件设计特异性引物并将引物序列交新疆昆泰锐生物技术有限公司合成，引物序列如表1，并分别在引物的上下游中添加BamH I和Hind III酶切位点。

2.2 ORF30基因的PCR扩增

将使用病毒DNA提取试剂盒提取病毒基因组，然后以EHV-1病毒ORF30基因组为模板，以选定P1和P2为特异性引物，对ORF30基因进行PCR扩增。 PCR扩增反应体系如下 （50 μL）：2Taq Master Mix25.0 μL，上游引物（10 μmol/L）1.0 μL，下游引物（10 μmol/L）1.0 μL，模板 DNA2.0 μL，无菌ddH2O 21.0 μL。PCR扩增反应参数如下：98℃预变性5 min，98℃变性5 min，53.98℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环。取扩增后得到的PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测确认。

2.3 目的基因的克隆

将回收获得的目的基因DNA片段与pMD19-T载体按照说明书要求进行连接，使用热转化方法将重组质粒转化到DH5α感受态细胞中，涂布于含有Amp＋抗性的LB固体平板用于筛选阳性重组质粒。挑取阳性重组菌进行活化扩增，次日使用天根质粒DNA提取试剂盒按照说明书操作提取重组质粒，对其进行PCR和质粒双酶切鉴定，分别收取PCR产物和质粒双酶切产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将鉴定为阳性的重组质粒命名为pMD19-T-ORF30，将鉴定成功的重组菌密封，送至新疆昆泰锐生物技术有限公司进行测序鉴定处理。

2.4 目的基因原核表达载体的构建及鉴定

将测序正确的pMD19-T-ORF30质粒与pET-32a（+）表达载体共同使用BamH I、Hind III进行双酶切；取双酶切产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，按照说明书操作步骤使用天根凝胶回收试剂盒将检测正确的双酶切产物进行胶回收处理，胶回收后于16℃金属浴连接仪中连接3 h。连接产物转入DH5α感受态细胞，涂布于含有Kana+的LB培养板，37℃培养过夜。选取单克隆菌落并对其进行PCR鉴定；鉴定为阳性的重组质粒，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测序，测序重组质粒命名为pET28a-ORF30。

3 结果与分析

3.1 ORF30基因的PCR扩增结果

以EHV-1病毒ORF30基因DNA为模板，P1/P2为选为上下引物，用PCR扩增ORF30基因，经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，其清晰的条带约为1074bp，与预期的相符（图1）。

图1 ORF30基因PCR扩增结果

3.2 原核表达载体pET-28a(+)-ORF30的鉴定结果

构建的重组质粒pET-28a(+)-ORF30经BamhⅠ和HindⅢ双酶切，后经1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果与预期相符（图2），表明目的片段成功插入载体pET28a(+)中。采用特异性引物对重组质粒pET28a(+)-ORF30进行PCR鉴定，产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察，得到一条大小约1074bp的清晰条带（图3），与目的基因大小相符。对阳性重组质粒测序，结果与GenBank公布序列一致，表明重组质粒pET28a(+)-ORF30构建成功。

图2 重组质粒pET-28a(+)-ORF30双酶切鉴定结果

图3 重组质粒pET-28a(+)-ORF30 PCR扩增结果

4 讨 论

本实验以疱疹病毒EHV-1 ORF30基因选为目的基因，对ORF30基因构建了重组原核表达载体pET-28a(+)，在适应的条件下对表达重组蛋白进行优化[9]，获得了较高水平的目的蛋白表达。蛋白作为诊断抗原可用于ORF30基因表达的诊断，为预防马鼻肺炎暴发提供了有利的依据。EIV-1毒株有高度保守的150kb双链DNA基因组，彼此间仅有0.1%的核苷酸差异。本研究发现EHV-1-XJ2015毒株ORF30基因，通过对ORF30基因部分克隆的氨基酸序列比较分析，发现EHV-1分离毒株具有氨基酸序列高度保守性[3]，甚至同源性达到为97.3%～100%，表明，EHV-1基因组中具有良好的完整性和保守性。在少数位点出现的差异可能与病毒的生存的环境及其宿主的适应性有关，但对ORF30基因2254点部位的鉴定和分析，可确定DNA聚合酶对此突变密切相关。

大肠杆菌是基因表达的重要工具[10]，在生物技术进入基因工程时代，蛋白质结构和功能的研究不断的更深对基因方面的研究提出了更高的技术。本实验以pET-28a(+)载体为原核表达载体，构建了ORF30基因的原核表达载体，这为进一步制备EHV-1病毒DNA聚合酶多克隆抗体奠定了基础。

大肠杆菌蛋白表达系统是最常用的表达系统，是使用最广泛且最经济实惠的蛋白表达系统。此种方法具有遗传稳定、表达质量较高、表达后的产物容易提纯、成本较低等优点，这也是选择大肠杆菌作为表达工具的主要原因。

本研究从新疆分离株中扩增了EHV-1-XJ2015/ORF30基因，进行了PCR扩增，将原核表达载体pET-28a(+)与ORF30基因重组，进入DH5α感受态细胞，将表达目的蛋白质（DNA聚合酶），为进一步探讨马疱疹病毒1型ORF30基因遗传变异对DNA聚合酶功能的影响奠定了基础。

5 结 论

本研究成功构建原核表达载体pET-28a(+)-ORF30，采用特异性引物对重组质粒pET28a(+)-ORF30进行PCR鉴定，片段大小为1074bp，将测序结果与GenBank的EHV-1 ORF30基因进行对比，其核苷酸序列同源性为99%。