可溶化结合超声预处理对酪蛋白酶解产物ACE抑制活性的影响

杨 雪 李云亮 王禹程 黄姗芬 陆 峰 马海乐*

（1 承德医学院基础医学院 河北承德067000 2 江苏大学食品与生物工程学院 江苏镇江212013）

酪蛋白是牛乳中最主要的蛋白质成分，分子质量在20～25 ku 之间，约占牛乳总蛋白质的80%以上[1]，但是由于酪蛋白的蛋白单体通过α-螺旋、β-折叠和β-转角等蛋白质二级结构形成紧密的酪蛋白空间结构，所以在人体内难以消化，并存在易过敏的缺陷，这些因素限制了酪蛋白在食品领域中的应用[2]。近年来在酪蛋白水解物中发现很多具有重要生理功能的多肽[3-4]。用酪蛋白制备多肽，不仅能防止酪蛋白产生的过敏反应，同时还可为机体提供大量具有生物学功能的多肽。制备多肽还是提高酪蛋白利用率的有效方法。

多肽因具有多种生物学活性，无毒副作用而广泛应用于保健食品的开发。酶解法是制备多肽常用的方法之一[5-6]，然而传统的酶解方法存在许多缺点，例如酶解时间长，酶利用率低及底物转化率低等。这主要是由于在酶解过程中的不均匀搅拌，引起底物与酶的低接触频率，酶活降低以及蛋白质的聚集和沉积[7]。因此，研究人员一直在研究不同的加工方法，以提高酶的利用率、底物的转化率，缩短酶解时间。

近年来，超声波技术迅速发展，被广泛应用于辅助制备多肽的工艺中。有研究表明，超声波可以显著提高酶解产物的生物学活性[8-9]。酪蛋白呈酸性，在碱性条件下缓慢溶解。采用经可溶化预处理的酪蛋白为底物，酶解制备ACE 抑制肽鲜有报道。因此，本文采用酪蛋白为原料，研究可溶化、超声以及可溶化结合超声预处理对酪蛋白酶解产物ACE 抑制活性的影响，以期为蛋白预处理工艺研究提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

酪蛋白，美国Sigma-Aldrich 公司；碱性蛋白酶（酶活257 364.5 U/mL），诺维信有限公司；血管紧张素转化酶（Angiotensin I-converting enzyme，ACE），根据Maruyama 等[10]方法制备；N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-[3 -（2 -furylacryloyl）]-L -phenyalanyl -glycyl -glycine，FAPGG），美国Sigma-Aldrich 公司；试验中使用的其它试剂均为分析纯级。

1.2 仪器及设备

超声波细胞粉碎机，无锡市上佳生物科技有限公司；Tecan Infinite PRO TWIN 200 多功能酶标仪，瑞士帝肯（TECAN）集团公司；上海雷磁ZD-2 型自动电位滴定仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；HH-501 超级恒温水浴锅，金坛市白塔新宝仪器厂；DL-5 台式离心机，上海安亭科学仪器厂；S-433D 氨基酸分析仪，赛卡姆（北京）科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酪蛋白酶解 称取20 g 酪蛋白，加入400 mL 蒸馏水，于50 ℃水浴预热10 min，混匀的同时用1 mol/L NaOH 调节pH 值至8.0，然后开始酶解，具体步骤：加入0.5 mL 碱性蛋白酶开始酶解，酶解过程中不断滴加1 mol/L NaOH，保持pH 值恒定，并记录NaOH 用量，以预先设定的水解度为终点，记录不同水解度条件下消耗的时间，酶解结束后于沸水浴条件下灭酶10 min，冷却至室温，调节pH 值至7.0 后，于10 000 r/min 离心10 min，取上清液待测。

1.3.2 可溶化对酪蛋白酶解效果的影响 称取20 g 酪蛋白，加入400 mL 蒸馏水，放于50 ℃水浴中，调节pH 值至8.0 后，保温至酪蛋白全部溶解后开始酶解，操作步骤同1.3.1 节。

1.3.3 超声预处理对酪蛋白酶解效果的影响 称取20 g 酪蛋白，加入50 ℃预热的蒸馏水400 mL，超声10 min 后，放入50 ℃水浴预热10 min，混匀的同时用1 mol/L NaOH 调节pH 值至8.0，然后开始酶解，操作步骤同1.3.1 节。

1.3.4 可溶化结合超声对酪蛋白酶解效果的影响称取20 g 酪蛋白，加入400 mL 蒸馏水，放于50℃水浴中，调节pH 值至8.0 后，保温至酪蛋白全部溶解，然后超声10 min，超声结束后将烧杯取出放入50 ℃水浴预热10 min，混匀的同时用1 mol/L NaOH 调节pH 值至8.0，然后开始酶解，操作步骤同1.3.1 节。

1.3.5 水解度（DH）的计算 蛋白酶解过程中水解度的计算方法采用pH-stat 方法[11]，其计算公式如下：

式中，h——被裂解的肽键数；htot——为常数，即每个底物中蛋白中含有的肽键总数，酪蛋白为8.2 mmol/g[4]；B——消耗的碱液体积，mL；N——碱液浓度，mol/L；α——酪蛋白的平均解离度；m——底物中蛋白质总质量，g。

1.3.6 酪蛋白酶解产物ACE 抑制率的测定ACE 抑制活性的测定方法参照丁青芝[12]的方法稍有修改[13]。（1）缓冲液的配制：称取HEPES 1.910 g 和NaCl 1.755 g，加适量的蒸馏水，搅拌至将其完全溶解后，调节溶液pH 值至8.3，定容至100 mL，于4 ℃保存备用。（2）FAPGG 的配制：称取19.97 mg FAPGG，加缓冲溶液溶解并定容至50 mL，于4 ℃避光保存备用。（3）样品的配制：酶解液样品用缓冲液稀释150 倍，ACE 用缓冲液稀释80 倍。ACE 抑制率的测定方法及加样顺序见表1。

表1 ACE 抑制活性的测定方法Table 1 Determination method of ACE inhibitory activity

在340 nm 波长下，分别测定对照孔和样品孔的初始吸光度（a1和b1），酶标板于37 ℃条件下保温30 min 后再测定其吸光度（a2和b2），每个样品测定3 次重复。对照孔的吸光度减少值A=a1-a2，样品孔的吸光度减少值B=b1-b2。酶解液样品ACE抑制率的计算公式如下：

1.3.7 多肽含量测定 取1.25 mL 样品溶液，加入2 mL 10%三氯乙酸（TCA）溶液，混匀后静置30 min，然后10 000 r/min 离心10 min，将上清液全部转移到50 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。多肽含量采用福林酚法测定，具体试验步骤参照Ledoux 和Lamy[14]的试验方法，样品于680 nm波长下测定其吸光值。

1.3.8 酶解液的氨基酸组成分析 酶解液氨基酸含量测定方法参照Li 等[15]。不同预处理后的蛋白酶解液样品放在密封管中，在110 ℃条件下用6 mol/L HCl 水解24 h。水解后用滤纸过滤样品，并定容至50 mL。取出1 mL 稀释样品，通过0.22 μm膜过滤后，使用氨基酸分析仪进行分析。

1.4 数据分析

试验结果采用SPSS 21.0 软件单因素方差分析 （IBM 公司，NY，USA）P<0.05 的显著性水平下进行分析。图表采用OriginPro8（OriginLab 公司，MA，USA）绘制。

2 结果与分析

2.1 不同预处理方式对酪蛋白不同水解度酶解产物的ACE 抑制率的影响

不同预处理方式对酪蛋白不同水解度酶解产物的ACE 抑制率的影响见图1，不同方式预处理酪蛋白，其酶解产物的ACE 抑制活性均呈相同趋势，即随着水解度的不断升高，酶解产物的ACE抑制活性呈先升高后趋于平缓。由图1a 可知，酪蛋白直接进行酶解，其酶解产物的ACE 抑制活性在水解度为15%时达到最大值，随后保持平稳，在水解度为21.3%时达到酶解终点。由图1b 可知，酪蛋白经过可溶化处理之后，其酶解产物的ACE抑制活性在水解度为17%时达到最大值，随后保持平稳，在水解度为24.58%时达到酶解终点。由图1c 可知，酪蛋白经过超声预处理，其酶解产物的ACE 抑制活性不断增加（P<0.05），在水解度为19%时达到最大值，随后保持平稳，在水解度为25.95%时达到酶解终点。由图1d 可知，酪蛋白经过可溶化结合超声预处理后，其酶解产物的ACE抑制活性在水解度为19%时达到最大值，随后保持平稳，在水解度为31.08%时达到酶解终点。

图1 不同预处理方式对酪蛋白不同水解度酶解产物的ACE 抑制率的影响Fig.1 Effect of different pretreatments on ACE inhibitory rate of hydrolysate with different DH of casein

在酪蛋白相同水解度条件下比较可知，不同的预处理方式其酶解产物ACE 抑制活性由高到低排序依次为：可溶化结合超声、超声、可溶化、对照。例如，在水解度为19%时，与对照组相比，可溶化、超声和可溶化结合超声预处理酪蛋白，酶解产物的ACE 抑制活性分别提高了17.96%，25.32%和34.33%。且不同预处理方式，酪蛋白最终水解度不同，也就是说，不同的预处理方式均改变酪蛋白的酶解终点。原因可能是：（1）在酶解过程中，可溶化或超声均可促进蛋白溶解，增加了酶与底物之间的接触频率，提高了酶解效率；（2）碱性蛋白酶在酶解的过程中会随酶解时间的延长，酶活逐渐丧失，超声作用可在一定程度上提高碱性蛋白酶的酶活[16]，延长蛋白酶灭活时间。可溶化与超声预处理均能提高酪蛋白酶解产物的ACE 抑制活性，可溶化提高酶与底物的接触频率，超声使酪蛋白改性为更易酶解的结构，因此可溶化结合超声预处理方式综合了两者的优势，不仅在蛋白构象上更加适宜蛋白酶酶解，并且在酶与底物的接触频率方面也显著提高，从而提高了酶解产物的ACE 抑制活性。

2.2 不同预处理方式对相同水解度条件下酪蛋白酶解时间的影响

不同预处理方式对相同水解度条件下酪蛋白酶解时间的影响见图2，由图2可知，在酶解前期，不同处理对酪蛋白酶解时间的变化不明显，随着酶解过程的进行，在相同水解度条件下，可溶化、超声及可溶化结合超声3 种预处理方式均能缩短酶解时间，这与Madadlou 等[17]的研究结果一致，其研究结果表明，超声可大幅度缩短（6 倍）酪蛋白制备ACE 抑制肽的时间。结合2.1 节的试验结果得出，不同的预处理均可缩短酶解时间，并提高酶解产物的ACE 抑制活性，其中可溶化结合超声预处理的效果最佳。

2.3 不同预处理方式对酶解终点多肽含量的影响

不同预处理方式对酶解终点多肽含量的影响见图3，由图3可知，与对照组相比，不同预处理方式均可显著提高酶解终点的多肽含量（P<0.05），其中可溶化与超声处理无显著差异（P>0.05），3 种预处理方式分别提高了17.54%，20.89%和32.09%。此结果与ACE 抑制活性的结果一致。由此可知，3种预处理方式均能通过提高酶解液中多肽的含量来提高酶解产物的ACE 抑制活性。Zou 等[18]的研究结果也表明，超声能够显著提高酶解产物中多肽的含量和活性。且可溶化结合超声预处理方式提高酶解液中多肽含量的幅度最大，这说明此种处理方式对于制备ACE 抑制肽来说是相对更有效的预处理方法。

图2 不同预处理方式对酪蛋白相同水解度条件下酶解时间的影响Fig.2 Effect of different pretreatments on enzymatic time of different DH of casein

图3 不同预处理方式对酶解终点多肽含量的影响Fig.3 Effect of different pretreatments on peptide content of enzymatic terminal point

2.4 不同预处理方式对酶解产物氨基酸组成的影响

不同预处理方式对酶解产物氨基酸组成的影响见表2，由表2可知，不同预处理方式均能显著提高酶解产物中总氨基酸含量和疏水性氨基酸含量，其中，可溶化结合超声预处理方式增加疏水性氨基酸及总氨基酸的含量幅度最大。有研究表明，疏水性氨基酸与酶解产物的ACE 抑制活性有关[19-20]。因此可以得出，不同预处理方式可通过改变酶解产物中疏水性氨基酸含量而提高其活性。疏水性氨基酸含量的增加表明不同的预处理方式均能使碱性蛋白酶更容易攻击疏水基团，生成短链的具有ACE 抑制活性的多肽，从而提高酶解产物的ACE 抑制活性。

表2 预处理方式对酶解产物氨基酸组成的影响 （μg/mL）Table 2 Effect of pretreatments on amino acid composition of hydrolysate （μg/mL）

3 结论

本文研究了可溶化、超声及可溶化结合超声预处理对酪蛋白碱性蛋白酶及产物ACE 抑制活性的影响，以及不同预处理方式对酪蛋白酶解终点多肽含量及氨基酸组成的影响。得出以下4 个结论：

（1）可溶化、超声及可溶化结合超声预处理均能提高相同水解度条件下酪蛋白酶解产物的ACE抑制活性；

（2）可溶化、超声及可溶化结合超声预处理可改变酪蛋白的酶解终点；

（3）可溶化、超声及可溶化结合超声预处理可通过提高酶解产物中疏水性氨基酸的含量来提高酶解产物的ACE 抑制活性；

（4）可溶化结合超声是相对更有效的预处理酪蛋白制备ACE 抑制肽的方式。