MAGOH在胶质瘤组织中的表达及其临床意义

刘杰，张德龙，毛捷，夏大勇，徐善水

(皖南医学院弋矶山医院神经外科，安徽 芜湖 241001)

脑胶质瘤的发病率占颅内原发性肿瘤的40%～60%[1]，近年来稳居原发性中枢神经系统肿瘤发病率第一位且有持续上升趋势。胶质瘤具有高发病率、高侵袭性、高复发率等特点，患者中位生存期仅有12～16个月，目前临床上对胶质瘤的治疗主要以手术切除为主，并辅以放、化疗，但整体治疗效果并不能令人满意，因此从病因学角度研究胶质瘤发生、发展过程对于正确认识其发病机制及优化胶质瘤治疗方案十分必要[2-4]。通过数据挖掘，我们发现mago-nashi同源基因(MAGOH)在不同级别胶质瘤组织中存在明显表达差异性，即MAGOH表达量越高，胶质瘤组织分级越高。因此，本研究通过测定并分析MAGOH在胶质瘤组织中的表达情况以探索MAGOH有无成为胶质瘤标志物的潜力，以及它对胶质瘤预后的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中国脑胶质瘤基因组图谱(Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)数据库 CGGA数据库是包含有数百例胶质瘤患者齐全生物信息资料的数据库。本研究回顾性分析了来自于CGGA m RNA microarray 数 据 库 (http：//www.cgga.org.cn/Uploads/201709/CGGA_mRNA_microarray_C&M.data.included_301.xlsx)和CGGA m RNA seq FPKM数据库(http：//www.cgga.org.cn/Uploads/201709/CGGA_ALL_m RNAseq_C&M.data.available_325(IDH_updated).xlsx)的301例和325例脑胶质瘤患者的临床资料与m RNA芯片数据。

1.1.2 胶质瘤样本 本研究所采用组织标本共58例均来源于自2013年1月—2017年12月在皖南医学院第一附属医院弋矶山医院神经外科行手术治疗的患者，其中正常组织样本10例，低级别胶质瘤14例(WHOⅠ/Ⅱ)，高级别胶质瘤34例(WHOⅢ/Ⅳ)，所纳入胶质瘤标本均经我院病理科证实。入选标准为病理诊断为神经胶质瘤(WHOⅠ～Ⅳ级)，40＜年龄(岁)＜90，既往无特殊病史。入选样本部位：额叶、颞叶、顶后叶、岛页、胼胝体区。48例患者平均年龄为(58.32±10.47)岁。10例正常组织样本来源于外伤患者，所有入选患者或患者家属均签署知情同意书，同意参与科研项目，本研究取得医院伦理委员会批准。样本采集清理后立即放置于液氮中，RNA通过Trizol法获得并储存于-80℃环境中。采用WHO胶质瘤病理分级对样本进行分组。由于组织样本大部分来自于额叶、颞叶，而其他区域样本量较少，根据采集区域对样本进行分组后统计功效不高，因此，本研究未讨论样本采集区域与MAGOH表达水平的关系。

1.1.3 试剂/试剂盒 见表1。

表1 试剂/试剂盒

1.2 方法 本研究使用R语言对CGGA数据进行差异表达分析和生存分析。其中差异表达使用limma软件包进行分析。使用Origin Pro进行统计绘图。

1.2.1 Quantitative Real-Time PCR(qRT-PCR) 总RNA使用Trizol法从组织或细胞中提取。取1μg总RNA作为逆转录模板。按照K1622逆转录试剂盒说明书进行逆转录。逆转录成功后使用QuantiNovaTMSYBR○RGreen PCR kit在QuantStudio3仪器上进行荧光定量PCR，实验具体操作步骤遵循对应试剂盒说明书。引物：GAPDH(product length=123)Forward 5′-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3′， Reverse 5′-GAACGGGAAGCTCACTGG-3′;MAGOH(product length=74)Forward 5′-TGGAAGTTCAGGCTCGGTTG-3′，Reverse 5′-TTGTGCCCCACGTAGTAACG-3′。

2 结果

2.1 MAGOH的表达量在IDH1突变组显著下调CGGA m RNA测序数据中包含IDH1、TP53突变的资料。我们对IDH1突变和MAGOH表达量之间的关系做了分析。发现在IDH1突变组的MAGOH表达量显著下调(图1A)，而MAGOH的表达量和TP53突变无明显关联(图1B)。

图1 MAGOH与IDH1突变和TP53突变之间的关系

2.2 MAGOH与O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)表达存在显著正相关 现有研究表明MGMT基因表达升高可作为接受放化疗的间变性星形细胞瘤患者的独立预后生物标志物。本研究分析了MAGOH和MGMT蛋白的表达关系，发现MAGOH与MGMT的表达呈现明显正相关(见图2)。

图2 MAGOH与MGMT相关性分析

2.3 CGGA数据库中MAGOH表达量与肿瘤分级呈正相关 在CGGAmRNA seq FPKM数据中，MAGOH表达量呈现显著差异，并且与胶质瘤分级显著正相关(图3A)。在CGGAmRNA microarray数据中，MAGOH表达量呈现显著差异，但WHOⅣ比WHOⅡ略低(图3B)，为确定MAGOH的表达量是否与胶质瘤分级呈正相关，因此我们做了qRT-PCR验证。

图3 MAGOH的表达量与胶质瘤WHO分级的关系

2.4 MAGOH的表达量在胶质瘤组织中显著上调且与胶质瘤分级呈正相关 MAGOH的表达量在CGGA数据库中已表现为显著上调。我们在临床胶质瘤标本中使用qRT-PCR技术检测MAGOH在各样本中的表达量，结果显示MAGOH的表达量和样本WHO高低分级呈现显著相关性(见图4A)，即随着样本中MAGOH表达量的增加，WHO分级也呈递增趋势。这与CGGA数据相符，在组织标本中的ROC曲线，下面积达到0.94，见图4B，这表明MAGOH的表达量在胶质瘤的诊断中具有良好的效能。

图4 qRT-PCR检测MAGOH在胶质瘤组织标本中的表达情况

2.5 高表达MAGOH预示不良预后 CGGA m RNA seq FPKM与CGGA mRNA microarray两个数据库的生存分析显示MAGOH在胶质瘤组织中的表达量和患者预后存在显著关联(见图5A、图5B)。MAGOH高表达组的预后明显差于低表达组。

图5 CGGA数据库中MAGOH的表达量与生存率的关系

3 讨论

MGMT是一种DNA修复酶，目前已经证实甲基化状态下的MGMT启动子能够预测胶质瘤对替莫唑胺的敏感程度[5]，亦有文献指出MGMT的表达调控通路可能与TP53基因密切相关[6]，Dora等[7]的研究进而发现，p53对MGMT的表达调节机制是通过阻断MGMT启动子与Sp1转录因子的结合实现的。本研究中，通过对CGGA数据库进行数据挖掘并分析，发现MAGOH与MGMT的表达量亦呈正相关。MA-GOH在IDH1突变型胶质瘤组织中的表达量明显下调，而与TP53基因无明显关联。IDH1突变是在胶质瘤中首先被发现代谢物编码基因异常[8]。研究发现，IDH1突变在低级别胶质瘤组织中普遍存在，约占70%左右[9]，且IDH1突变型患者预后明显比IDH1野生型患者好，IDH1可作为预测胶质瘤预后的独立指标[10]。这提示在胶质瘤组织中MAGOH在胶质瘤中有深入研究价值。进一步的研究发现，MAGOH在胶质瘤中表达量显著上调，且与胶质瘤WHO分级正相关。

MAGOH是人类与果蝇mago nashi基因高度同源的基因，位于人类第1号染色体短臂第3区，分子量为17164Da，mago nashi基因可参与调解雌雄同体生物性别决定蛋白的表达，如血吸虫。另外，mago nashi基因已发生突变的果蝇所繁衍出的后代在胚质组合及种系进化过程中存在一定程度缺陷，这种突变基因亦可编码哺乳动物的mago nashi同源基因，从而引起哺乳动物的生物学特性改变。目前，临床上对MAGOH与人类疾病之间关系的研究报道较少，在脑部肿瘤的报道更为鲜见。

在CGGA数据库中我们进一步分析了MAGOH与预后的关系，生存分析显示高表达的MAGOH预示着不良的预后，这与MAGOH在胶质瘤中高表达趋势相符，这也提示了MAGOH可能参与胶质瘤的恶性行为。已有的研究表明MAGOH蛋白、核糖核酸结合基序蛋白8A(RNAbinding motif protein 8A，RBM8A，亦称Y14)共同作为外显子连接复合体(Exon junction complex，EJC)形成二聚体，作为EJC的核心成分[11]。RBM8A是一种在细胞内广泛表达的保守蛋白质[12]。EJC与m RNA的生成代谢关系紧密，可与m RNA结合而影响mRNA剪接、m RNA定位、翻译和m RNA降解[13-14]。MAGOH/RBM8A复合物对EJC调控转录过程十分重要。其他的研究发现RBM8A-MAGOH复合体可能影响中心体的定位而参与了有丝分裂的调控[15]。MAGOH表达量的改变能影响 MAGOH/RBM8A复合物的形成，这可能是MAGOH参与胶质瘤恶性行为的机制之一。

总而言之，我们发现MAGOH的表达与胶质瘤WHO分级正相关，且在IDH1突变组中下调，其表达量与患者生存率呈负相关。MAGOH对胶质瘤有良好的诊断效能，我们认为MAGOH是潜在的胶质瘤生物标志物，且可能参与胶质瘤恶性行为，下一步将进行深入研究。