miR-422a过表达联合EPO对H2O2诱导的PC12细胞活力、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响

顾 然，王 露，唐 蔓，胡 晓

贵州省人民医院神经内科 贵阳 550002

有研究[1-2]表明，帕金森病、阿尔茨海默症等多种神经退行性疾病的发生发展与氧化应激密切相关。过氧化氢(H2O2)是一种氧化性较强的活性氧，可诱导细胞氧化应激损伤。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类高度保守、长18～25个核苷酸的非编码小分子RNA，可通过与目标基因的3’-UTR结合，在转录水平调节目标基因表达[3]。miR-422a是miRNAs家族成员之一，有研究[4]表明，在H2O2诱导的大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12细胞凋亡模型中，miR-422a的表达降低，提示miR-422a可能在神经损伤过程中有重要作用。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是一种具有抗氧化、调节红细胞生成、抗炎、抗细胞凋亡等多种生物学效应的细胞因子;在多种神经系统疾病模型中发挥保护作用，其保护作用机制可能与抗氧化应激、抗凋亡、抗炎作用等有关[5-6]。本研究旨在分析过表达miR-422a和EPO单独或联合作用对H2O2诱导的PC12细胞活力和凋亡的影响，并进一步研究其作用机制，以探讨miR-422a是否可增强EPO对氧化损伤的PC12细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司，MTT试剂盒、DMSO均购自美国Sigma公司，鼠抗人AKT、p-AKT抗体均购自美国CST公司，细胞凋亡检测试剂盒、流式细胞仪均购自美国BD公司，总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒均购自日本TaKaRa公司,miR-422a mimics 及空质粒均购自上海吉玛制药技术有限公司，LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2细胞培养PC12细胞购自中国科学院上海细胞库。细胞在体积分数5%CO2、37 ℃条件下，用含体积分数10%FBS的DMEM培养基培养。2～3 d换液一次。细胞进入对数生长期后，用胰蛋白酶消化、传代。

1.3实验分组及处理将PC12细胞分为6组。空白组：细胞不经特殊处理；H2O2组：细胞用300 μmol/L H2O2处理4 h；miR-NC组：H2O2刺激前细胞转染空质粒48 h；miR-422a组：H2O2刺激前细胞转染miR-422a mimics 48 h(100 nmol/L)；EPO组：H2O2刺激前用1 IU/mL EPO处理细胞2 h；miR-422a+EPO组：H2O2刺激前用miR-422a mimics及EPO同上处理细胞(先转染，后加EPO)。将PC12细胞以2×105个/孔接种于6孔板，于培养箱内常规培养，细胞达50%～70%生长融合度时开始转染，参照LipofectamineTM2000试剂盒说明操作。

1.4qRT-PCR检测miR-422a的表达用总RNA提取试剂盒提取空白组、H2O2组、miR-NC组、miR-422a组细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度，应用反转录试剂盒合成cDNA。miR-422a及内参U6引物由上海吉玛公司设计并合成。miR-422a上游引物为5’-GGGACTGGACTTAGGGTCA-3’，下游引物为5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’，产物63 bp；U6上游引物为5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物为5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’，产物78 bp。反应体系(20 μL)：2×SYBR premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，ROX Reference Dyell 0.4 μL， cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.6 μL；反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。每组设6个复孔，取Ct均值，采用2-ΔΔCt法计算miR-422a相对表达量。实验重复3次。

1.5细胞活力检测取对数生长期的PC12细胞，调整细胞密度为2×104个/mL，以每孔100 μL接种于96孔板，过夜培养。按1.3中实验分组处理后，每孔加MTT溶液(5 g/L)10 μL，继续孵育4 h，吸去培养液，每孔加150 μL DMSO，继续孵育10 min，酶标仪测定570 nm处的吸光度(A)值，代表细胞活力。每组设置5个复孔，实验重复3次。

1.6细胞凋亡检测取对数生长期的PC12细胞，以3×104个/孔接种于24孔板，常规培养24 h。按1.3中实验分组处理后，以预冷PBS洗涤细胞，加Annexin V binding buffer悬浮细胞，混匀，加5 μL的Annexin V-FITC及5 μL PI，轻柔混匀，避光室温反应15 min，加200 μL Annexin V binding buffer 400 μL，1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.7AKT、p-AKT蛋白检测收集各处理组细胞，加适量裂解液提取总蛋白，BCA法定量蛋白浓度。蛋白经100 ℃变性后，上样，每孔道40 μg，经120 g/L SDS-PAGE分离、转NC膜、50 g/L脱脂奶粉封闭，使用封闭液稀释一抗(鼠抗AKT、p-AKT抗体及内参GAPDH抗体均按1∶1 000稀释)，室温摇床孵育3～4 h，洗膜，加HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体(按1∶5 000稀释)，37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL显色，显影。Quantity One软件分析蛋白条带灰度值。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。实验重复3次。

1.8统计学处理应用SPSS 21.0处理数据，采用单因素方差分析比较各组以上指标的差异，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1转染miR-422a mimics对H2O2诱导的PC12细胞miR-422a表达的影响如表1所示，H2O2刺激可降低PC12细胞miR-422a表达，转染miR-422a mimics后PC12细胞中miR-422a表达较H2O2组升高。

表1 4组细胞miR-422a 表达的比较

F=339.935,P<0.001;*：与空白组比较，P<0.05；#：与H2O2组比较，P<0.05

2.2过表达miR-422a或EPO对H2O2诱导的PC12细胞活力的影响如表2所示，H2O2刺激可降低PC12细胞活力，而过表达miR-422a及EPO均可提高细胞活力，两者合用对细胞活力的增强作用更强。

2.3过表达miR-422a或EPO对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的影响如表2所示，H2O2刺激可诱导PC12细胞凋亡，而过表达miR-422a及EPO均可降低细胞凋亡率，两者合用对细胞凋亡的抑制作用更强。

2.4过表达miR-422a或EPO对H2O2诱导的PC12细胞AKT及p-AKT蛋白表达的影响如图1和表2所示，H2O2刺激可下调PC12细胞p-AKT表达，而过表达miR-422a及EPO均可上调细胞p-AKT表达，两者合用对细胞p-AKT表达的上调作用更强。

1～6：分别为空白组、H2O2组、miR-NC组、miR-422a组、EPO组、miR-422a+EPO组

图1过表达miR-422a或EPO对H2O2诱导的PC12细胞AKT、p-AKT蛋白表达的影响

表2 6组细胞细胞活力、凋亡率及AKT、p-AKT蛋白相对表达量比较

*:与空白组比较，P<0.05；#:与H2O2组比较，P<0.05；△:与miR-422a组及EPO组比较，P<0.05

3 讨论

机体内活性氧过多可触发细胞的自由基链式反应，发生脂质过氧化反应，损伤细胞膜结构，影响酶功能、蛋白质结构及基因表达，引起细胞的氧化损伤[7-8]。H2O2、谷氨酸盐、t-BHP等常用于制作氧化损伤模型，由于H2O2具有易于取得、性质比较稳定等特点，应用最为广泛[9]。PC12细胞可长出类似神经元细胞的突触，有神经细胞的特性，又有增殖快的特点，因此成为神经细胞生理病理研究常用的细胞模型[10]。有研究[11]表明，300 μmol/L H2O2处理PC12细胞4 h，可抑制近一半的细胞活力，因此，本研究使用300 μmol/L H2O2刺激PC12细胞，建立细胞氧化损伤模型，研究结果显示，H2O2可抑制PC12细胞活力，诱导细胞凋亡，说明建立的PC12细胞氧化损伤模型成功。

miRNA在不同生物中有高度保守性，参与调控细胞凋亡、脂肪代谢、细胞分化、神经元发育等多种病理生理过程。miR-422a是miRNA大家族成员之一，与胶质母细胞瘤、肺癌等多种肿瘤细胞生长有关[12-13]。在H2O2诱导的PC12细胞凋亡模型[5]中，miR-422a表达下调，提示miR-422a可能参与PC12细胞凋亡调控。本研究结果亦显示，H2O2可下调PC12细胞miR-422a表达，而过表达miR-422a可增强氧化损伤的PC12细胞的活力，抑制细胞凋亡，从而减弱氧化应激诱导的细胞损伤。

EPO是主要在肝脏和肾脏产生的一种糖蛋白生血因子，能促进红细胞生成。有研究[14]证实，中枢神经系统中存在EPO及其受体基因表达，且EPO具有神经营养作用。研究[15]显示，EPO有强大的神经保护作用，如EPO可明显增强1-甲基-4苯基吡啶离子等诱导的PC12细胞活力，降低细胞凋亡率。本研究结果显示，EPO可增强H2O2诱导氧化损伤的PC12细胞活力，抑制凋亡，而过表达miR-422a与EPO联合作用在增强细胞活力和抑制细胞凋亡方面均优于单用。

PI3K/AKT是细胞内一条重要的信号通路，在中枢神经系统中，该信号通路是神经元存活的主要途径之一[16]。有研究[17]表明，PI3K/AKT信号通路活化对H2O2诱导的PC12细胞凋亡起保护作用。AKT是PI3K/AKT信号通路的中心环节，AKT活化后可通过调节下游相关基因表达而影响细胞生物学过程[18]。本研究结果显示，过表达miR-422a及EPO均可上调H2O2诱导的PC12细胞的p-AKT水平，两者合用对p-AKT水平上调作用更强。提示miR-422a及EPO可能通过激活PI3K/AKT信号通路保护神经细胞免受氧化损伤。

综上所述，过表达miR-422a及EPO均可抵抗H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤，两者合用效应更强，其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关；miR-422a可能是神经损伤治疗的分子靶点之一。