miR-577对脑胶质瘤U251细胞活力和凋亡的影响

方兴根，盛 斌

1)皖南医学院弋矶山医院神经外科 安徽芜湖 241001 2)皖南医学院第二附属医院神经外科 安徽芜湖 241001

脑胶质瘤是常见的中枢神经系统肿瘤，具有高侵袭性、易复发、病死率高等特点，目前尚无有效的治疗方法[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类非编码的单链小分子RNA，可通过特异性结合于靶mRNA的3’非翻译区(UTR)区，引起靶基因mRNA降解或翻译受阻，从而在转录后水平调节基因表达[2]。研究[3]显示，miRNA与肿瘤发生发展密切相关。miR-577是miRNA大家族成员之一，有研究[4-5]表明，miR-577与乳腺癌、甲状腺癌等多种肿瘤细胞生长密切相关。有研究[6]显示，长链非编码RNA ZEB1-AS1可通过调节miR-577促进脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移。Wnt/β-catenin信号通路是Wnt信号通路中的经典信号途径，其激活可促进多种肿瘤细胞生长，Wnt2b是Wnt/β-catenin信号通路关键分子，有研究[7]表明，miR-577可通过调节Wnt2b抑制非小细胞肺癌增殖和上皮细胞间充质化。miR-577是否可通过调节Wnt2b影响脑胶质瘤细胞生长还未明确。因此，本研究将过表达miR-577载体转染脑胶质瘤U251细胞，并验证miR-577与Wnt2b的靶向关系，旨在探讨miR-577是否可靶向调节Wnt2b从而影响U251细胞活力和凋亡。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器人脑胶质瘤U251细胞购自美国ATCC公司。RPMI 1640培养基购自美国HyClone公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司；反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；Trizol试剂、脂质体2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；pcDNA3.1质粒购自湖南丰晖生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；细胞凋亡检测试剂盒、流式细胞仪购自美国BD公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；酶标仪购自美国Thermo公司。

1.2细胞培养U251细胞用含体积分数10%FBS的RPMI 1640培养基，在体积分数5%、37 ℃细胞培养箱中常规培养、消化传代。取对数生长期U251细胞，以2×105个/孔接种于6孔板，于培养箱中常规培养，使转染时细胞达80%融合。将U251细胞分为miR-对照组(转染miR-577阴性对照)、miR-577组(转染miR-577模拟物)、抑制对照组(转染miR-577抑制物对照)、miR-577抑制组(转染miR-577抑制物)以观察上调及下调miR-577表达后Wnt2b表达的变化；将U251细胞分为miR-对照组、miR-577组、miR-577+Wnt2b组(转染miR-577模拟物与pcDNA-Wnt2b)以验证miR-577是否通过调控Wnt2b表达进而调控细胞增殖及凋亡；各组细胞均转染6 h后换为完全培养基继续培养48 h，收集细胞用于后续实验。

1.3qRT-PCR检测miR-577表达Trizol法提取转染48 h的细胞总RNA，参照反转录试剂盒反应体系及条件，将总RNA反转录为cDNA。miR-577 上游引物5’-TGCGGTAGATAAAATATTGG-3’, 下游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;内参U6上游引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’, 下游引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，共35个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-577相对表达量。实验重复3次。

1.4CCK-8法检测细胞活力取对数生长期的U251细胞，以1×104个/孔接种于96孔板，在培养箱内常规孵育24 h，按1.2分组处理U251细胞，于转染后24、48和72 h在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱内常规孵育4 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)值，以A值表示细胞增殖能力，每组设置5个复孔，实验重复3次。

1.5细胞凋亡率的检测收集转染后48 h的U251细胞，制备成单细胞悬液，离心，弃掉上清，PBS重悬细胞，取(1～5)×105个细胞，在细胞悬液中分别加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混匀后避光室温孵育15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.6miR-577靶基因预测及验证通过靶基因软件miRDB、miRNA.org和TargetScan 7.1分析，发现Wnt2b 3’UTR与miR-577种子区存在结合位点。构建野生型(WT)及突变型(MUT)Wnt2b 3’UTR区荧光表达质粒pGL3-Wnt2b，并与miR-577模拟物或抑制物共转染U251细胞，按照双荧光素酶检测试剂盒说明测定各组细胞的荧光强度。实验重复3次。

1.7Wnt2b蛋白表达的检测将适量RIPA裂解液加入转染后的细胞中，在冰上裂解反应30 min，离心，收集上清。BCA法测定蛋白浓度。蛋白与上样缓冲液混匀，100 ℃变性5 min。在每孔加入40 μg变性蛋白，经SDS-PAGE分离蛋白、转蛋白于PVDF膜及50 g/L脱脂奶粉液封闭膜，加鼠抗人Wnt2b抗体(美国Santa Cruz公司，1∶500稀释)及内参鼠抗人GAPDH抗体(美国Santa Cruz公司，1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜，加HRP标记的羊抗鼠二抗(美国Santa Cruz公司)，37 ℃摇床振荡封闭1 h，洗膜，ECL显色。Quantity One软件进行灰度值分析。以Wnt2b与GAPDH条带灰度值比值作为Wnt2b蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.8统计学处理采用SPSS 21.0进行数据分析。不同组间U251A值、凋亡率、Wnt2b蛋白相对表达量及3’UTR荧光素酶活性的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1U251细胞的转染效果以miR-对照组为1，miR-577组miR-577表达水平(6.183±0.597)升高。

2.2miR-577靶基因预测及Wnt2b蛋白表达测定结果miR-577组与miR-对照组比较，3’UTR WT荧光素酶活性及Wnt2b蛋白表达水平降低；miR-577抑制组与抑制对照组比较，3’UTR WT荧光素酶活性及Wnt2b蛋白表达水平升高。见图1、图2、表1。

图1 miR-577与Wnt2b 3’UTR的结合位点(红色部分)

1：miR-对照组；2：miR-577组；3：抑制对照组；4：miR-577抑制组

图2 4组U251细胞Wnt2b蛋白的表达

*：与miR-对照组和抑制对照组比较，P<0.05

2.3上调Wnt2b对miR-577过表达的U251细胞活力和凋亡的影响结果见表2。可知，miR-577组与miR-对照组比较，细胞活力降低，凋亡率升高；miR-577+Wnt2b组与miR-577组比较，细胞活力升高，凋亡率降低。

表2 3组U251细胞活力和凋亡率比较(n=3)

*：与miR-对照组比较，P<0.05；#：与miR-577组比较，P<0.05

3 讨论

与多数人类肿瘤类似，脑胶质瘤也是由多程序、多基因发展演变而来，各种致癌因素可激活一种或多种癌基因，或抑制抑癌基因，从而引起细胞增殖、侵袭和转移异常[8]。研究[9]表明，miRNA在肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因样作用，多个miRNA的异常表达可影响脑胶质瘤细胞生长。miR-577可影响肿瘤细胞生长，如过表达miR-577能够显著抑制SGC-7901细胞侵袭能力[10]；miR-577可通过靶向β-catenin抑制肝癌细胞生长[11]。以上研究提示miR-577在肿瘤发生及发展过程中有重要作用，但目前miR-577在胶质瘤中的研究较少。因此，本研究将过表达miR-577的载体转染脑胶质瘤U251细胞，通过CCK-8及流式细胞术分别检测细胞活力和凋亡率，发现过表达miR-577可明显抑制U251细胞活力和诱导细胞凋亡，提示miR-577可抑制脑胶质瘤细胞生长。

Wnt/β-catenin信号通路是一种在进化中高度保守的信号途径，参与细胞生长、增殖、凋亡、能量代谢等多种生物学过程的调控，其异常激活与多种肿瘤细胞生长密切相关[12-13]。有研究[14-15]显示，Wnt/β-catenin信号通路异常激活可影响脑胶质瘤细胞生长。Wnt2b是Wnt/β-catenin信号通路的关键分子，在多种肿瘤中呈现阳性表达，与肿瘤发展密切相关[16]。有研究[17]显示，miR-185-3p可通过靶向Wnt2b调节鼻咽癌细胞侵袭和迁移能力；上调lnc-SNHG1可通过抑制miR-577和激活Wnt/β-catenin信号促进骨肉瘤进展[18]。本研究通过双荧光报告基因检测系统证实Wnt2b是miR-577的靶基因。将过表达miR-577和Wnt2b载体同时转染U251细胞，发现过表达Wnt2b可减弱miR-577对细胞活力的抑制和促凋亡作用，提示miR-577可通过下调Wnt2b抑制脑胶质瘤细胞生长。

综上所述，本研究发现miR-577可抑制脑胶质瘤U251细胞活力，诱导细胞凋亡，其机制是靶向调节Wnt/β-catenin信号通路关键分子Wnt2b，提示miR-577可能是脑胶质瘤治疗中的一个有效分子靶点。但目前关于miR-577在脑胶质瘤细胞中的作用及机制研究相对较少，因此还需做进一步的深入研究。