耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌分子流行病学研究

龚 林，刘小丽，许慧琼，梁建生

(武汉市疾病预防控制中心消毒与病媒生物防制所，湖北 武汉 430015)

由于碳青霉烯类抗生素抗菌活性强且抗菌谱广，逐渐成为临床上治疗重症感染的主要药物[1]。但是，随着碳青霉烯类药物的广泛应用，耐碳青霉烯类药物的细菌不断增加，降低了该类药物的治疗效果[2]。细菌对碳青霉烯类药物耐药的主要机制之一是产碳青霉烯酶，通过分析产碳青霉烯酶菌株的分子流行特征，对预防和控制耐药菌的产生和耐药基因的传播具有重要意义。本研究对武汉两所医院临床分离的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)进行分子流行病学研究，为临床采取合理的防控措施提供实验室参考依据[3]。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集武汉两所医院2018年1—10月临床分离的非重复CRKP共42株。对亚胺培南，美罗培南和厄他培南3种药物其中的1种耐药，定义为耐碳青霉烯类药物。

1.2 仪器与试剂 主要仪器: PCR 扩增仪(美国ABI公司),全自动细菌鉴定及药敏分析系统(法国梅里埃公司),脉冲场凝胶电泳仪(美国伯乐公司),凝胶成像仪(美国UVP公司)。主要试剂: 细菌DNA提取试剂盒(北京康为世纪公司)，PCR反应试剂盒(日本Takara公司)。

1.3 菌株鉴定及药敏试验 细菌的鉴定和药敏试验采用全自动细菌鉴定及药敏分析系统完成，大肠埃希菌ATCC 25922作为对照菌。药敏分析结果按2018年版美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准进行判断。

1.4 碳青霉烯酶表型检测 采用Carba NP试验对CRKP菌株产碳青霉烯酶情况进行初筛。制备Carba NP溶液A和Carba NP溶液B，然后刮取平板上隔夜培养的受试菌株，分别加入装有Carba NP溶液A和Carba NP溶液B的离心管中，(35±2)℃孵育，孵育过程中每隔一段时间观察结果。结果判定：(1)若溶液A为红色或橙红色，且溶液B为浅橙色、黄色或深黄色，则结果判定为阳性；(2)若溶液A为红色或橙红色，且溶液B为红色或橙红色，则结果判定为阴性；(3)若溶液A为橙色、浅橙色、黄色或深黄色，则结果判定为无效，应结合其他试验判定。

1.5 碳青霉烯耐药基因扩增 采用细菌DNA 提取试剂盒并按照试剂盒提供的实验方法提取菌株DNA。采用普通PCR 方法扩增常见碳青霉烯耐药基因(包括KPC、VIM、IMP、NDM、OXA-48)。依据相关参考文献[4-8]设计引物和PCR扩增反应。PCR反应体系共50 μL，包括PCR反应试剂mix 25 μL，上、下游引物各1 μL、DNA模板1 μL，最后加H2O补足体积。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，选取阳性产物条带送往生工生物有限公司进行测序。

1.6 质粒接合试验 分别取隔夜培养的供体菌(携带碳青霉烯耐药基因的CRKP)和受体菌(大肠埃希菌J53 AZr)菌液，混合后于35 ℃培养4 h，然后接种于双抗LB平板(含叠氮化合物100 mg/L，亚胺培南1.5 mg/L)上筛选接合转移子[9]。将双抗平板上生长的菌株作菌落PCR试验，若PCR扩增结果为阳性，则可判定为接合试验成功。

1.7 菌株间亲缘关系分析 通过脉冲场凝胶电泳试验(PFGE) 分析产碳青霉烯酶基因CRKP菌株的亲缘关系。菌株包埋入胶块后，经裂解和清洗，使用限制性内切酶XbaI 进行酶切，然后在0.5×TBE 缓冲液中电泳18.5 h。电泳参数为电压6 V/cm、温度14 ℃、脉冲时间6～36 s。采用BioNumerics软件分析电泳凝胶成像图谱，图谱结果判读依据Tenover等[10]建议的标准。

2 结果

2.1 菌株来源 42株CRKP，其中分离自痰28株(66.7%)，分泌物6株(14.3%)，尿5株(11.9%)，血2株(4.8%)和穿刺液1株(2.4%)。来源科室分别为ICU 19株(45.2%)，呼吸内科11株(26.2%)，肝胆外科4株(9.5%)，普通外科4株(9.5%)，脑血管外科2株(4.8%)，急诊科和神经内科各1株(各占2.4%)。

2.3 碳青霉烯酶表型和基因检测结果 经Carba NP试验检测，碳青霉烯酶阳性率为33.3%(14/42)。PCR结果显示，13株耐药基因检测阳性，其中NDM阳性10株， KPC阳性3株。所有携带碳青霉烯酶基因的菌株Carba NP试验结果均为阳性。所有菌株均未检出VIM、IMP和OXA-48基因。NDM和KPC阳性产物经测序比对后，分别确定为NDM-1基因和KPC-2基因。Ⅰ医院检出5株NDM-1阳性菌株，Ⅱ医院检出5株NDM-1和3株KPC-2阳性菌株。见表1。

图1 42株肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药率

编号医院来源科室Carba NP试验耐药基因编号医院来源科室Carba NP试验耐药基因WH1Ⅰ尿普外科+NDM-1WH22Ⅱ痰ICU+KPC-2WH2Ⅰ尿普外科-WH23Ⅱ尿ICU+KPC-2WH3Ⅰ痰ICU-WH24Ⅱ分泌物肝胆外科-WH4Ⅰ尿普外科-WH25Ⅱ分泌物呼吸内科-WH5Ⅰ痰急诊科+WH26Ⅱ痰呼吸内科+NDM-1WH6Ⅰ痰神经内科-WH27Ⅱ痰ICU-WH7Ⅰ痰ICU+NDM-1WH28Ⅱ痰呼吸内科+NDM-1WH8Ⅰ痰ICU+NDM-1WH29Ⅱ痰脑血管外科-WH9Ⅰ痰ICU-WH30Ⅱ痰ICU-WH10Ⅰ痰ICU-WH31Ⅱ穿刺液肝胆外科+NDM-1WH11Ⅰ痰ICU-WH32Ⅱ分泌物ICU-WH12Ⅰ尿普外科+NDM-1WH33Ⅱ痰ICU-WH13Ⅰ痰ICU-WH34Ⅱ痰脑血管外科-WH14Ⅰ痰ICU-WH35Ⅱ痰ICU-WH15Ⅰ分泌物呼吸内科-WH36Ⅱ痰呼吸内科-WH16Ⅰ分泌物ICU-WH37Ⅱ痰呼吸内科+NDM-1WH17Ⅰ痰ICU+NDM-1WH38Ⅱ痰呼吸内科-WH18Ⅱ痰呼吸内科-WH39Ⅱ痰呼吸内科-WH19Ⅱ痰呼吸内科-WH40Ⅱ血ICU+NDM-1WH20Ⅱ痰ICU+KPC-2WH41Ⅱ痰呼吸内科-WH21Ⅱ血肝胆外科-WH42Ⅱ分泌物肝胆外科-

2.4 质粒接合试验和菌株药敏结果 10株NDM-1阳性CRKP菌株与大肠埃希菌J53的质粒结合试验获得了9个接合子，仅WH12 CRKP菌株未能接合成功。供体菌、接合子与受体菌药敏结果显示，除对氨曲南敏感外，所有接合子对绝大多数β-内酰胺类药物耐药，但耐药水平较供体菌有所降低。部分接合子对氨基糖苷类、氟喹诺酮类、磺胺类、四环素类药物敏感，但MIC值高于受体菌。3株KPC-2阳性菌株均接合成功，接合子对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、氟喹诺酮类药物均耐药，对阿莫西林/克拉维酸、氨基糖苷类、四环素类药物均敏感。

2.5 菌株间亲缘关系分析 PFGE分析结果显示，10株NDM-1阳性CRKP菌株图谱共分为6个型别，分别定义为A、B、C、D、F、G型；其中D型、E型各3株，C型和F型分别各2株，A型、B型和G型各1株，其中3株D型均来自Ⅱ医院呼吸内科，2株F型均来自于Ⅰ医院的ICU。3株KPC-2阳性菌株均为E型，来自于Ⅱ医院的ICU。见图2。

图2 携带碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌PFGE 分析

3 讨论

肺炎克雷伯菌常定植于人体肠道和呼吸道，可引起消化道、血液、呼吸道、皮肤软组织等部位感染，是临床上常见的条件致病菌之一[11]。碳青霉烯类药物作为广谱抗菌药物，是治疗肺炎克雷伯菌的重要药物之一，随着碳青霉烯类药物在临床的广泛应用，CRKP逐年增加。本研究中分离的CRKP菌株大部分来源于ICU，患者病情严重、长期住院、免疫力低下，较容易感染耐药菌。同时，CRKP多分离自痰标本，提示此类耐药菌常定植于呼吸道，引起呼吸系统感染。NDM-1和KPC-2的检出率分别为23.8%(10/42)和7.1%(3/42),低于既往研究[12-14]的数据，提示产NDM-1和KPC-2的CRKP菌株在此两所医院流行率相对较低。另外，也可能是医院监测系统不完善，未能发现所有产酶菌株。

本研究显示，14株CRKP菌株Carba NP试验初筛碳青霉烯酶阳性，经过PCR检测显示其中有13株CRKP菌株扩增出碳青霉烯酶基因，仅有1株CRKP菌株未能扩增出碳青霉烯基因，表明Carba NP试验在检测碳青霉烯酶时具有很高的灵敏度和特异度。Vasoo等[15]研究结果表明，Carba NP试验对常见的碳青霉烯酶(OXA-48除外)检出率很高，灵敏度和特异度接近100%。与本实验研究结论类似，表明该方法可以用于对碳青霉烯酶进行初筛。

本研究13株产碳青霉烯酶CRKP菌株中有12株成功进行了质粒接合试验，表明耐药基因可通过质粒介导在不同细菌间水平传播。对接合子和受体菌的药敏结果进行分析，携带NDM和KPC基因的菌株对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类等抗菌药物的MIC均相对较高。对接合子和供体菌的药敏结果进行分析，供体菌除了携带碳青霉烯基因外，可能还获得了其他耐药元件、耐药基因或其他耐药机制等，使得菌株产生更高水平的耐药。

本研究对13株携带NDM-1基因和KPC-2基因的CRKP进行PFGE分型，结果显示10 株携带NDM-1基因CRKP菌株共分为6个型，无明显优势型；然而，3株携带KPC-2基因CRKP菌株则为同一型别，且集中分布于ICU。PFGE分型结果提示，两所医院可能存在KPC-2基因克隆传播，NDM-1基因克隆传播和水平传播并存的现象。此两种方式会加速碳青霉烯酶基因在医院内和医院间的传播，从而引起更多的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物产生耐药。

综上所述，两所医院分离的CRKP与其携带的碳青霉烯酶基因NDM-1和KPC-2有关，且该类基因可通过质粒转移在细菌间进行水平传播。因此，应高度重视碳青霉烯酶基因导致的碳青霉烯类耐药[16]，制定和实施有效的多重耐药菌防控措施，从而可减少其在医院内和医院间的传播。