烟草酶促棕色化反应机理及其调控研究进展

杨 树 勋

（甘肃省烟草公司陇南市公司，陇南746000）

酶促棕色化反应是绿色植物细胞正常的生理生化反应，在提高植物抗性、调节光合作用等方面发挥着积极的作用［1］。烟草酶促棕色化反应是指烟叶在烘烤过程中，在氧化酶的作用下叶内内含物质转化，烟叶颜色由黄色逐渐变棕、变褐这一复杂的过程。烟草酶促棕色化反应主要发生在烟叶变黄末期和定色期，由于叶内氧化酶（主要是多酚氧化酶PPO）活性较强，烟叶含水率较高，叶内含有较高的多酚类物质，如咖啡酸、绿原酸、芸香苷等，以及外界温湿度条件适合，造成叶内氧化还原平衡被打破，使细胞中的多酚类物质被氧化而不能被还原，多酚类物质被氧化成醌，醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，产生黑色素沉淀。随着醌类物质聚集，烟叶的基本黄色会逐渐丧失，呈现出不同程度的杂色，造成烟叶挂灰、蒸片、黑糟等；同时酶促棕色化反应还会使烟叶叶片变薄，重量减轻，弹性变差，破碎度加大，燃烧力减弱，使烟叶的质量下降。由于多酚类物质是构成烟叶品质和香吃味的必备物质，因此，酶促棕色化反应的发生是造成烟叶质量下降的重要原因之一。弄清酶促棕色化反应机理及发生条件，对防止烟叶酶促棕色化反应的发生，提高烟叶质量具有重要意义。

1 烟草酶促棕色化反应研究现状

烟叶烘烤经历了阳光干燥阶段、简单加工阶段、经验（简单火管）烘烤阶段、技术烘烤阶段、科学烘烤阶段五个阶段［2］。自进入技术烘烤阶段以来，人们对烟草酶促棕色化反应的认识在逐渐深入。普遍认为：烟叶烘烤过程中，在变黄前期，由于烟叶细胞组织结构完整，细胞中多酚氧化酶与咖啡酸、绿原酸、芸香苷等多酚类作用底物各处于一定的区隔，二者不容易接触［3］，而且此时细胞处于生命活动较旺盛状态，既进行氧化作用又进行还原作用，氧化还原反应能够保持平衡，因此棕色化反应不易发生。

在变黄后期及定色期，叶组织细胞逐渐死亡，细胞结构开始自溶和解体，细胞膜透性增大，使多酚类物质、氧气可以自由进出细胞组织，多酚氧化酶、多酚类物质、氧气很容易接触，多酚类物质只能被氧化，很少被还原，使多酚类物质被迅速氧化成醌类，醌类物质积累和聚合成为深色物质，同时造成烟叶质量的下降，如下图：

Akehurst研究表明［4］，绿原酸和芸香苷是两种影响烟叶等级较大的多酚类物质，烟叶中多酚类物质的含量与烟叶品质和芳香吃味是一致的；烘烤过程中酶促棕色化反应的发生，是造成烤后烟叶多酚类物质含量低的主要原因。Johnson等人研究发现［5］，烟叶中多酚类物质含量一般在 1.8% ～5.2%，一旦烟叶颜色完全变褐，多酚类物质含量就会减少85%，烟叶的芳香吃味会因此而变差，杂气加重。烟叶酶促棕色化反应往往发生于变黄时间过长或定色太晚的情况下，此时除具有良好的氧化条件外，也与糖分消耗过度，使葡萄糖提供氢将醌还原的能力降低有关，导致醌类物质积累，烟叶颜色变深。因此，烟草酶促棕色化反应发生既有内部因素，也必须具备外部条件。

1.1 影响酶促棕色化反应发生的内部因素

酶促棕色化反应受多种因素影响，是一个相当复杂的过程，烟叶自身素质是酶促棕色化反应发生的基础。影响酶促棕色化反应的内在因子有：烟叶组织细胞结构的破坏程度、烟叶组织的失水量、PPO活性。

（1）烟叶组织细胞结构的破坏程度。在烘烤变黄过程中，随着烟叶的呼吸作用，内含物被大量消耗，叶内不断失水，细胞结构遭到破坏，叶组织的生命活性趋于死亡（一般烟叶致死的环境温度为50～52℃）［6］。细胞膜的选择透性逐渐丧失，膜透性增大，原生质结构解体，将导致：一是原生质大量外渗；二是氧自由进入叶组织；三是细胞内各种物质与酶混杂在一起；四是细胞内糖分消耗过度，葡萄糖提供氢还原能力下降。从而使细胞正常的生理代谢功能丧失，生命活性降低，细胞中的氧化还原平衡被打破，从而导致酶促棕色化反应发生。

（2）烟叶组织的失水量。烟叶酶促棕色化反应必须是在细胞尚处于有生命状态下才能进行，而叶内水分状况决定着酶的活性强弱，因此，在变黄接近完成时，叶内水分状况是决定酶促棕色化反应能否发生的必备条件。一般认为，变黄末期，烟叶失水量少于50%，就为酶促棕色化反应的发生奠定了基础，失水量大于50%，酶促棕色化反应就很难发生［6～8］。

（3）PPO活性。PPO是一类普遍存在于植物、真菌和昆虫质体中，由核基因编码，能与铜相结合的金属蛋白酶［9］。它能分别催化单酚羟基和二羟基酚氧化为O-二酚和O-醌。PPO广泛存在于植物体的各种器官或组织中，一般幼嫩部分含量较多，成熟部分含量较少。细胞化学和细胞免疫化学分析表明，PPO是一种质体酶，存在于正常细胞的内囊体的囊泡内。植物PPO是许多果蔬等农产品酶促褐变的主要原因。烟叶的酶促棕色化反应是在PPO的催化作用下发生的。因此，PPO的活性及其在烘烤过程中的变化也就成为烟叶棕色化变褐与否的决定因素。在烟叶烘烤过程中，影响PPO活性的主要因素有环境温度和水分。

生物酶都有其适应的温度范围。一般情况下，温度低时PPO活性低，随着温度的升高，PPO活性有升高的趋势，但当超过一定的温度时，随着温度的升高，PPO活性下降。温度对PPO活性主要有两个方面的影响：一方面，在适宜温度范围内，随着温度的上升或下降，酶活性降低；另一方面，活性酶的浓度下降。温度对PPO活性的影响是两个方面综合作用的结果。戴亚等［10］研究发现，PPO在温度20～50℃范围内保持着较高的活力，并且其活性均在40℃左右时最高，在40℃以下PPO是相当稳定的，但当温度超过55℃时，易迅速钝化失去活性。雷东锋等［11］等研究烟草中 PPO在 35、40、45、50、55、60、65、70和75℃等烘烤温度下的热敏感性，发现35℃时PPO的活性最高，随着温度的升高，PPO活性逐渐降低。韩富根等［12］发现，在不同温度下烟草PPO的活性或早或迟地都要出现一个高峰，温度越高，活性上升越快，活性越强，酶活性持续的时间越短，反之亦然，当温度在55℃以上时，就会迅速钝化失去活性。总之，一般认为，烘烤的环境温度不同，烟叶PPO活性强弱表现也不同，烟叶中PPO在35～40℃活性最高，稳定性最好。

由于生物的生理生化反应必须在溶胶状态下进行，所以烟叶的水分状况决定着其生命活动的强弱。当烟叶失水量超过50%时，细胞原生质的粘性增大，限制了底物的流动性，PPO活性受到抑制。综上，学界认为：PPO在温度45～50℃、相对湿度60%以上时被活化，在温度55℃、相对湿度60%以下时受到抑制。

1.2 影响酶促棕色化反应发生的外部因素

在正常的烘烤过程中，酶促棕色化反应是很少发生的，烟叶棕色化变褐的程度也极其微小，对烟叶质量的影响效应并不显著。但是，当烘烤操作技术不当时，会诱导酶促棕色化反应的发生。哈斯勒（Hassler）研究发现［5］，在烘烤环境温度低于 44℃时烟叶变褐速度极为缓慢，当升高到57℃时，仅6 min棕色化反应过程就可全部完成。诱导烟叶酶促棕色化反应的外部因素有两个：一是烘烤温度，二是烤房内空气的相对湿度。两者共同影响烟叶含水量和叶内多酚氧化酶的活性，从而制约酶促棕色化反应的发生。一般认为，当烟叶变黄后，如温度超过44℃、环境相对湿度60%以上、烟叶失水量少于50%三个条件同时具备时，将导致酶促棕色化反应的发生，否则酶促棕色反应就不容易发生［7］。

1.3 对酶促棕色化反应的调控

有学者认为［13］，可以从三个方面对酶促棕色化反应进行调控。一是调控多酚类物质的含量。通过品种选育、合理的农业栽培措施、使用植物生长调节剂等，降低酶促棕色化反应的发生。有研究指出，烘烤前用抑制剂处理能使多酚含量达到人们所要求的范围。二是调控多酚氧化酶的活性。通过调整烤房内的气体成分、热处理、高压、辐射和超声处理等破坏酶促反应赖以发生的生理生化环境，从而降低PPO的活性。韩富根等［12］通过试验表明，酶促褐变最适宜的pH范围在4～7，降低介质中的pH，可以控制PPO的活性，抑制其催化作用。还可通过喷洒、浸泡化学抑制剂或者直接加入缓冲液等方法来抑制PPO的活性。肖厚荣等［14］研究表明，胱氨酸对烟草中的PPO有抑制作用，当胱氨酸与PPO的分子比达到16 000∶1时，PPO的活性被完全抑制。三是降低氧的浓度。降低烘烤环境中氧气的浓度可有效减少棕色化反应的发生。有研究指出，在烘烤过程中，当氧气浓度在0.01%时，酶促褐变基本上不会发生；当氧气浓度高于0.5%时，随着氧气浓度的增加，烟叶褐变程度逐渐加重［15］。

在生产上普遍认可的调控酶促棕色化反应的方法是：在烟叶基本变黄后，控制好温、湿度及烟叶含水量，在温度45℃以前，失水超过50%，进入定色阶段后，缓慢升温，加快排湿，达到烟叶小卷筒，定色阶段保持60%以下的相对湿度，及时钝化和终止PPO活性，防止烟叶氧化变褐。

2 烟草酶促棕色化反应研究中存在的问题

国内外学者对烟草酶促棕色化反应机理进行了一系列的研究，虽取得了一些成果，但对烟草酶促棕色化反应的认识还不够深入，对烟草酶促棕色化反没有形成一个统一、完整的认识，也没有找出酶促棕色化反应的核心控制因子。主要存在以下问题：

一是对于发生烟草酶促棕色化反应的条件以烤房内温度、相对湿度等外部条件为主，没有揭示出烟草酶促棕色化反应的核心要素。

二是对烟草PPO活性适宜温度认识有差距。戴亚等［10］认为PPO在40℃左右活性最高，而雷东锋等［11］认为烟草PPO在35℃时活性最高，但在此温度范围内一般并不发生棕色化反应。韩富根等［12］认为，当温度在55℃以上时，PPO就会迅速钝化失去活性。而哈斯勒［5］认为，当温度升高到57℃时，仅6 min棕色化反应过程就可全部完成。

三是在酶促棕色化反应过程中对酶的氧化性研究较多，而忽视了酶的还原性。

四是烟叶组织细胞结构破坏程度的问题。传统认为烟叶组织致死的环境温度为50～52℃，超过此温度，烟叶组织生命趋于死亡，细胞结构遭到破坏，从而发生酶促棕色化反应。但当操作不当时，在50～52℃前酶促棕色化反应已经发生。

五是在酶促棕色化反应的调控方面，总结出了调控多酚类物质的含量、PPO的活性、降低氧的浓度等多种方法，但这些方法在生产中实施难度大，有些方法还可能对烟叶质量造成伤害。

六是对烟草酶促棕色化反应发生机理没有一个系统的、能广泛涵盖内、外条件的概述。

七是忽视了能量代谢的作用。烟草酶促棕色化反应过程是一个可逆过程，在酚被氧化成醌的同时，醌也被还原成酚，从能量代谢的角度看还原反应也需要吸收能量。

八是长期以来我国传统烟草教科书中棕色化反应化学式［3］不正确，醌的苯环上碳原子有五个共价键、氧原子有三个共价键。

3 烟草酶促棕色化反应的科学原理初探

3.1 烟草酶促棕色化反应的实质

烟叶烘烤过程是烟叶叶片衰老死亡的过程［16］。在烘烤过程中，在叶片没有变黄前，组织细胞结构完整、能量充足、抗逆性好、生命活性较强，氧化还原作用保持平衡，即使烤房内温湿度较高，也不会发生酶促棕色化反应。随着衰老的加深，细胞组织的抗逆功能、自我修复功能、还原功能衰退，提供还原反应需要的能量衰减。在叶片变黄后（变黄后期及定色期），虽然叶片组织尚处于有生命状态，但叶组织生命趋于、临近死亡，生命活性较弱。同时叶片含水率较高，烟叶失水率不超过50%，细胞原生质处于溶胶状态下，底物具有流动性。如温湿度控制不当，超出了叶组织细胞生命的极限温度，叶组织细胞逐渐死亡，细胞结构开始自溶和解体，细胞膜及内囊体膜上的蛋白质逐渐变性失活，膜的选择透性逐渐丧失，底物与酶之间的区隔被破坏，膜透性增大，使多酚类物质、活性氧、PPO很容易接触。细胞组织酶的氧化活性与还原活性此消彼长，平衡被打破，酶的氧化活性占据优势，加之细胞内糖分消耗过度，葡萄糖提供氢还原能力下降，还原反应需要的能量衰竭，使氧化反应与还原反应平衡被打破，氧化反应占据优势。多酚类物质只能被氧化，很少被还原，使多酚类物质被迅速氧化成醌类，从而导致酶促棕色化反应发生，如下图：

从外观颜色看，酶促棕色化反应发生在烟叶变黄后；从内部结构看，酶促棕色化反应发生在烟叶细胞将死但未死，细胞生命处在生命活性较弱向死亡过度时期，膜的选择透性逐渐丧失；从内含物看，氧化反应的底物充足而还原反应的底物少；从酶的活性看，随着细胞的衰老死亡，酶的还原活性下降快，酶的氧化还原活性平衡被打破；从能量代谢的角度看，随着烟叶的衰老，细胞组织提供还原反应所需能量的功能下降；从细胞抗逆力看，随着细胞的衰老，生命活力的下降，细胞抗逆力下降，细胞组织的致死温度下降，当湿烟叶组织温度达到或超过38℃时（变黄后湿烟叶组织细胞致死温度为38℃），细胞组织逐渐死亡，颜色变褐。

3.2 烟草酶促棕色化反应的条件

虽然烟草酶促棕色化反应机理非常复杂，调控因子多且各因子之间互相影响，但其发生烟草酶促棕色化反应的核心要素是一致的。发生烟草酶促棕色化反应必须具备以下三个条件：一是烟叶叶片变黄后，即发生在变黄后期、定色期；二是叶片失水率不超过50%，原生质尚处于溶胶状态；三是湿烟叶组织温度超过38℃。只有达到以上三个条件，才会导致酶促棕色化反应的发生。

3.3 烟草酶促棕色化反应的调控

生产实践证明，只要理清了烟草酶促棕色化反应机理及关键控制因子，找出烟草酶促棕色化反应的本质，生产上防止酶促棕色化反应这一矛盾就会迎刃而解。总之，在烟叶烘烤过程中只要控制好以下几点就能防止酶促棕色化反应的发生：在变黄期保持一定的失水速度，在变黄的同时使叶片的含水量保持在一个适宜的范围内并逐渐减少；烟叶变黄后加快失水，延长时间；在烟叶达到充分凋萎、主脉发软（失水30%）前组织温度不超过37℃；在定色期烟叶小卷筒（失水50%）前烟叶组织温度不超过38℃；在烟叶烘烤过程中烟叶组织温度与失水进程协调，水、温同步。否则就可能发生棕色化反应，使烟叶变褐，从而导致质量下降。

4 展望

虽然前人对烟草酶促棕色化反应机理及调控因子进行了大量研究，并取得了一定成就，但烟草酶促棕色化反应中有许多问题尚不清楚，有待进一步研究完善。笔者认为，在研究烟草酶促棕色化反应机理上，不但要从微观上破解酶促棕色化反应发生的成因，而且要用动态的、联系的观点从宏观上加深对酶促棕色化反应发生的认识与理解，分清主要矛盾和矛盾的主要方面及在其一定条件下相互转化的规律，找准酶促棕色化反应的核心要素，才能抓住酶促棕色化反应的实质，更好地为优质烟叶生产服务，使烟叶生产在我国的经济建设上发挥更大的作用。