CRISPR/Cas技术及其在作物遗传育种中的应用

刘 忠 奇

（1湖南农业大学农学院，长沙410128；2中国种子集团有限公司，北京100045）

基因编辑技术具有巨大的应用价值。目前主要有类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）［1］、锌指核酸酶（ZFN）［2］和成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白（CRISPR Cas9和 CRISPR Cpf1）［3］三大基因编辑技术。由于基因组编辑技术克服了周期长、突破物种间生殖隔离限制及快速高效的优势而被科学界关注。基因组编辑技术可用于基因修复（Gene correction）、基因敲除 （Knock-out）和实现靶向（Targeted）插入目标基因［4］。作为基因编辑技术的后起之秀，CRISPR/Cas9系统因其精准性、高效性、低成本性和简易性，而受到各界密切关注，而且在越来越多的研究领域得到应用。笔者拟介绍基因编辑CRISPR/Cas系统的作用机理以及该系统在作物遗传育种中的最新研究和应用进展，并就该项技术在植物遗传育种应用中的新思路及安全性提出新的方向。

1 CRISPR/Cas与ZFN、TALEN的作用机理及异同

目前应用最广泛的基因组编辑技术主要有ZFN（zinc finger nuclease）、TALEN（transcription activator-like effector nuclease）和 CRISPR/Cas，它们均能对植物基因组进行精准的替换、插入和定点敲除，其在作物重要性状的遗传改良和控制作物重要农艺性状基因的功能鉴定领域具有巨大的应用潜力。

ZFN技术是最早兴起的第1代基因组编辑技术。ZFN是由一系列位点特异性的融合蛋白组成，主要包含锌指蛋白的DNA结合域和核酸内切酶FokⅠ的切割结构域［5］。将锌指蛋白与核酸内切酶FokⅠ融合形成核酸内切酶，利用它可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口。但ZFN存在设计锋指核酸酶耗时耗力、锌指核酸酶上下游效应等导致脱靶效应、ZFN本身的细胞毒性等缺陷，制约了ZFN在基因组编辑中的应用。

TALEN是一种毒性蛋白，由黄单胞杆菌（属植物病原菌）通过Ⅲ型分泌系统释放到宿主细胞中通过模拟真核细胞转录因子对宿主细胞实现重编程［6］。TALEN与ZFN类似，其原理一样，均由DNA结合蛋白与核酸内切酶FokⅠ融合而成。对每个新的目标序列，两种基因编辑技术都需要设计一个新的DNA长片段（500～1500碱基对）来合成相应的目的蛋白。由于非特异性核酸内切酶FokⅠ形成二聚体才有内切酶活性，ZFN和TALEN均需要合成两个新的蛋白。综上，上述两种技术相对费时且效率低。

CRISPR/Cas是来源于细菌和古生菌抵抗病毒或外源质粒入侵的获得性免疫系统［7］，主要有3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。被广泛应用的主要是Ⅱ型系统，以 Cas蛋白（Cas9、Cpf1、C2c1和 C2c2）以及导向RNA（gRNA）为核心组份。主要依赖于核酸内切酶在目标位置产生双链断裂 （double strand breaks，DSBs），DSBs再通 过 非 同 源 末 端 连 接（NHEJ）和同源重组（HDR）两种方式进行修复。NHEJ在断裂位点诱发碱基缺失或插入突变，故可针对不同靶位点设计不同单向导RNA（sgRNA）在特定的位点实现基因编辑，包括间隔序列的获取、CRISPR/Cas系统的表达和CRISPR/Cas系统对外源基因的干扰三个阶段［8］。Cas9蛋白作为Ⅱ型系统的核心蛋白，具有加工产生 crRNA（CRISPR RNA）和切割外源核酸的功能，Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA（反式激活crRNA）三者共同作用即可对外源 DNA进行靶向裂解［9～11］。CRISPR/Cas9对 DNA的靶向切割作用使其可以用来进行基因组编辑。在特定的区域内，CRISPR/Cas9可以同时编辑多个基因位点［12～17］。最近从氨基酸球菌属中分离出的CRISPR/Cpf1（V-A）系统，在哺乳动物特定位点中的编辑效率更高［18］。

ZFN、TALEN和CRISPR/Cas都是有效的基因组编辑技术，三者在编辑效率、特异性和设计上存在较大差异（表1）。

表1 三大基因编辑技术比较Table 1 Comparison of the differences between the threemajor gene editing technologies

2 CRISPR/Cas9技术在植物基因功能研究中的应用

CRISPR/Cas系统通过产生DNA双链断裂激活植物内源修复途径（包括非同源粘性末端连接和同源重组修复）实现对靶位点的定点突变、缺失或者基因的插入与替换。

2.1 基因敲除

王芳权等［19］利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种南粳9108中的Pi21基因进行敲除，获得78.57%的突变效率，且靶位点突变类型较多。Wang等［20］通过 CRISPR/Cas9技术敲掉了六倍体植物小麦的TaMLO基因，获得了抗白粉病小麦新品系。Gao等［21］通过CRISPR/Cas9系统敲除烟草的2个基因NtPDS和NtPDR6，发现16.2%～20.3%的插入或缺失频率。刘耀光实验室开发的多靶点CRISPR/Cas9系统，更加有效地实现了多基因定点突变及大片段缺失，他们在水稻中编辑了46个目标位点，平均突变率为85.4%，且大部分为双等位和纯合状态［13］。

2.2 基因插入或替换

胡雪娇等［22］采用CRISPR/Cas9系统矮化水稻恢复系申繁17和申繁24获得了较野生型矮25%的SD1突变体，以SD1基因为靶基因，构建基因编辑载体CRISPR-SD1，T0代获得了纯合的sd1突变体，T1代株系中分离出了不含转基因序列的植株。Fang等［23］通过CRISPR/Cas9系统以大豆疫霉菌的RXLR效应基因Avr4/6作为靶标进行编辑，导致Avr4/6基因被NPTII基因替换。

Feng等［24］采用CRISPR/Cas9技术对拟南芥和水稻3个容易观察表型的基因（ROC5、SPP和YSA）进行了编辑，结果显示在T1代转基因株系中，SPP突变效率为5%，ROC5和YSA突变效率高达26%～84%。Lu等［25］利用单碱基编辑系统APOBEC1-XTEN-Cas9（D10A），首次实现了对水稻氮转运蛋白家族NRT1.1B和 DELLA家族SLR1的碱基替换。Upadhyay等［26］成功地运用基因编辑技术在悬浮细胞中，多重的sgRNA定位两个不同识别位点，将两个小麦内源基因Ta INOX和Ta PDS突变掉，突变率达到18%～22%。

以上均表明CRISPR/Cas9系统（敲除、插入或替换）在植物T0代转化中是高效的，很容易找到靶标基因完成编辑的纯合子，筛选得到纯合的T0代突变株系。这些基因能够稳定地遗传给T1代，且符合孟德尔分离规律。

2.3 候选基因功能预测

利用CRISPR/Cas9技术对小麦Ta MLO进行定向突变，在原生质体和转基因植物中的鉴定结果表明，突变只发生在 A基因组上［27］。Gao等［28］通过CRISPR/Cas9技术定点编辑产生ABP1的无效突变体abp1，并发现abp1不对外源的生长素表现抗性，故认为ABP1不是拟南芥生长素信号传导过程中的关键因子。Sun等［29］运用CRISPR/Cas9设计了一个携带Cas9，两个gRNA和作为同源性修复模板的一个供体片段的质粒，试图通过质粒轰击，在水稻ALS基因中同时替代两个氨基酸残基（W548到L和S627到I），从再生苗中随机选择52株进行分析，测序结果表明，所有分析的植物中都发生了CRISPR/Cas9介导的同源性修复，获得了纯合的抗除草剂水稻植株。

Svitashev等［30］使用127 nt的单链 DNA寡核苷酸作为修复DNA模板并与Cas9-ALS-gRNA RNP复合物共同轰击，在玉米乙酰乳酸合酶基因（ALS2）中直接将对应于氨基酸位置165处的Pro的DNA序列编辑为Se（P165S），产生氯磺隆抗性玉米植株。从1个再生植株中检测到编辑的ALS2等位基因的DNA序列分析证实了P165S修饰的存在以及与相应修复模板相关的其他核苷酸变化。进一步的分子分析和后代测试表明，T1植株对氯磺隆具有抗性，且后代符合孟德尔分离规律。Yin等［31］利用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1系统分别敲除水稻OsEPFL9基因（EPFL9基因为气孔发育的正调节因子），获得的纯合突变体水稻背轴叶表面上的气孔密度显著降低。Xu等［32］针对水稻除草剂抗性基因BEL设计3个不同gRNAs，分析发现CRISPR/Cas系统突变效率在2%～16%，表型分析显示转基因植株对除草剂苯达松敏感。

3 CRISPR/Cas9技术在植物分子育种中的应用

CRISPR/Cas9系统具有简单易行、突变效率高、成本低、多靶点同时突变等优越性，能有效地应用于水稻的遗传改良。现在利用CRISPR/Cas9技术开展与产量、品质及抗性相关的研究已有大量报道。

在产量方面，王加峰等［33］利用CRISPR/Cas9技术对调控水稻千粒重的基因TGW6定点编辑，T0代材料中该基因突变频率约为90%，其中纯合缺失突变率高达51%，T1代纯合缺失突变体千粒重显著增加。

Zhang等［34］利用 CRISPR/Cas9系统对小麦粒长和粒重调控基因Ta GASR7和穗密度调控基因Ta DEP1进行定点编辑，获得的Ta GASR7纯合。Soyk等［35］采用 CRISPR/Cas9技术对番茄抗成花基因SP5G进行定向编辑，突变体材料番茄开花及成熟时间提前约2周，且产量显著增加。

在品质方面，Tang等［36］利用 CRISPR/Cas9系统敲除金属转运蛋白基因OsNramp5，显著降低籼稻谷粒中的镉含量，开发具有低Cd积累和无转基因的新籼稻品系。中国水稻研究所［37］和东北地理与农业生态研究所［38］同时采用CRISPR/Cas9技术对控制水稻香味的BADH2基因进行敲除，结果表明突变体材料中香味物质显著增加。Ma等［13］利用CRISPR/Cas9技术靶向突变直链淀粉合成酶基因OsWaxy，突变体直链淀粉含量从14.6%下降至2.6%，获得了糯性品质。

在抗性方面，Li等［39］将 CRISPR/Cas9系统成功应用于编辑大豆的乙酰乳酸合成基因1（ALS1）并获得了氯磺隆抗性基因。Wang等［20］通过CRISPR/Cas9技术敲掉了六倍体植物小麦的Ta MLO基因，获得了抗白粉病小麦新品系。中国科学院遗传与发育生物学研究所，利用NHEJ修复方式建立了基于CRISPR/Cas9的基因组定点插入及替换系统，在水稻内源基因5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）中实现基因替换，频率为2.0%，靶向基因插入，频率为2.2%，所获OsEPSPS基因的水稻对草甘膦具有抗性［40］。Liu等［41］利用CRISPR/Cas9基因修饰增强水稻抗稻瘟病能力，设计针对水稻OsERF922基因的CRISPR/Cas9 SSN（C-ERF922），从50个T0转基因水稻中鉴定出21个C-ERF922诱导的突变体（突变率42.0%），获得了6个抗稻瘟病株系。

在筛选不育系方面，主要利用CRISPR/Cas9系统对籼稻和粳稻品种的温敏不育基因TMS5的野生型基因进行突变，可快速培育出温敏不育系。2016年，张大兵等利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑粳稻品种空育131内源基因csa，获得了粳型光敏核雄性不育系［40］。同年 11月，庄楚雄等利用 CRISPR/Cas9技术对水稻温敏核雄性不育基因TMS5进行特异性编辑，创制了一批温敏核雄性不育系［41］。

4 CRISPR/Cas9技术的脱靶问题及应对策略

CRISPR/Cas作为一种新型的应用技术，虽然具有高效、廉价和易操作的优势，但是也有多变效应，即脱靶问题。为了提高效率，越来越多的研究着眼于控制CRISPR/Cas9系统的脱靶突变。gRNA和同源序列中选择具有最少的错配位点和脱靶位点的目的位点［42～44］，有助于确保 CRISPR/Cas9的识别特异性。由于Cas9核酸酶在植物中有较高的编辑效率和特异性［45］，选择合适的靶点显得尤其重要，因此在农作物中比较容易得到一个脱靶率非常低的纯合突变体。有研究者将Cas9转换成切口酶，同样能够帮助减少脱靶突变，确保CRISPR/Cas9定点切割的效率。CasOT是最近发明的一个灵活的选择工具，能够识别整个基因组中潜在的脱靶位点［44］。新型小核酸酶Cpf1是可代替Cas9的有效工具，具有更高的精确性和更简便的操作性，能降低脱靶效应。

5 展望

基因组编辑技术在植物育种的背景下进行应用，重点是开发新品种。优化现有技术，创新新型基因组编辑育种技术，开发具有自主知识产权的DNA-free剪切酶技术，有助于提高基因组编辑技术的精确性和高效率性。

此外，基因编辑作物是否属于转基因生物在国际上尚没有明确的定论，其监管标准也存在争议。所以加强基因编辑作物的监管法规建设十分必要，应组织科学界、管理者、产业界等共同研讨，制定切实可行的法规，严格监控其应用范围和程度，在符合安全标准的情况下发展基因组编辑育种技术。由于CRISPR/Cas9系统编辑的作物可以不引入外源基因，得到纯合的突变体，与天然植物基因突变一样，具有稳定的遗传能力，随着全基因组测序的完成和更多有利性状或基因被发现，基因编辑技术必将在植物育种界对新种质资源的创制和农艺性状的精准改良产生深远的影响。