鞘氨醇1-磷酸盐受体拮抗剂（FTY720）对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型皮肤中γδT细胞的作用研究

覃慧 郑捷

上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科 200025

目前银屑病的发病机制尚不完全清楚，但普遍认为皮损中存在的炎症性细胞因子如白细胞介素（IL）17A、IL-17F、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-22及分泌IL-23 的树突细胞、单核细胞在疾病发生发展中起着关键作用[1]。研究表明，缺乏γδT 细胞的小鼠在IL-23 或咪喹莫特（imiquimod，IMQ）刺激下皮肤表皮厚度和炎症明显减轻[2]，银屑病小鼠模型真皮中的γδT 细胞具有迁移能力，在稳定状态下，小鼠淋巴结中部分分泌IL-17 的γδT 来源于皮肤，提示IL-17+γδT 细胞在皮肤和淋巴结间可能存在动态变化[3-4]。皮肤淋巴细胞抗原（cutaneous lymphocyte antigen，CLA）特异性表达于具有组织迁移能力的细胞，介导细胞归巢至组织。鞘氨醇1-磷酸盐（sphingosine-1-phosphate，S1P）受体拮抗剂（FTY720）能有效下调表达于致病性T 淋巴细胞上的S1P受体1（S1P1），抑制细胞的迁移，降低炎症因子的产生[5-7]，但其是否可通过阻断组织之间致病性细胞的交流以缓解银屑病的报道较少。本研究通过研究FTY720对银屑病小鼠模型的治疗作用及分子机制，为FTY720 进一步应用于银屑病治疗提供理论依据。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

IMQ（美国3M 公司），FTY720、胶原蛋白酶Ⅳ、透明质酸酶、DNA酶Ⅰ（美国Sigma公司），RPMI 1640培养基（美国GIBCO 公司），胎牛血清（FBS，美国GIBCO公司），淋巴细胞分离液（Ficoll，美国Biowest公司），固定/破膜（Fixation/Permeabilization）工作液、10×洗液（10×Wash buffer）、高尔基体抑制剂（Golgiplug，美国Biolegend公司）。流式抗体为大鼠抗小鼠单抗，由美国Biolegend 公司生产，主要有Fc-blocker、PE 标记的 CLA（CLA-PE）、Percp/cy5.5标记的 CD3（CD3-Percp/cy5.5）、APC 标记的 S1P1（S1P1-APC）、APC 标记的γδ（γδ-APC）、APC/cy7 标记的 Viability Dye（Viability Dye-APC/cy7）、PE/cy7标记的IL-17（IL-17-PE/cy7）、PE/cy7标记的γδ（γδ-PE-cy7）、PE/cy7 标记的IgG1（IgG1-PE/cy7）、FITC标记的CD45（CD45-FITC）、APC 标记的Gr1（Gr1-APC）、PE/cy7标记的CD11b（CD11b-PE/cy7）。40 μm无菌细胞筛（美国VWR公司），流式细胞仪（CantoⅠ，美国BD公司）。

二、实验动物

8 只 6 ～ 8 周龄、体重 18 ～ 20 g、SPF 级雌性C57BL/6 小鼠购自美国Charles River 实验室，饲养于美国University of Louisville 动物房SPF 环境，动物实验许可证号（Institution Animal Care and Use Committee：16574）。按小鼠体重随机分为 2 组，小鼠每只耳朵涂抹10 mg/d IMQ，连续涂7 d，实验组3 只小鼠于第2（D1）、4、6 天腹腔注射FTY720，对照组5 只小鼠注射无菌磷酸盐缓冲液（1 × PBS，pH7.4）。PBS用量为200 μl，FTY720用量为1 mg/kg，溶于PBS[8]。在实验过程中由D0至D7每天测量鼠耳厚度，D7处死小鼠，取双耳皮肤及双侧颈部引流淋巴结。腹腔注射FTY720及测量耳厚度均在当天涂抹IMQ之前进行。

三、方法

1.鼠耳朵皮肤组织病理：小鼠处死后取耳朵1 cm × 0.5 cm 皮肤组织，包埋冰冻组织块，切片后-80 ℃保存。取冰冻切片行常规HE 染色，光镜下观察。取冰冻切片，-20 ℃丙酮固定30 min，通风干燥 30 min，置于 5 片式染缸，PBS 洗 3 次，滴加20% FBS，于4 ℃封闭过夜，PBS 洗1 次后加入Gr1单抗（1∶100稀释），4 ℃避光过夜，PBS洗3次，吸取表面残留水珠，滴加DAPI染色10 min，PBS洗3次，滴加防淬灭剂，封片。荧光显微镜下观察结果并拍照。

2.皮肤细胞获取：处死小鼠后剪下双耳皮肤并剪成肉糜状，与皮肤消化酶（胶原蛋白酶Ⅳ、透明质酸酶、DNA酶Ⅰ）中37 ℃旋转消化2 h，采用2 ml针筒内芯研磨，通过40 μm 无菌细胞筛，1 800 r/min（离心半径14 cm，离心半径下同）离心7 min，弃上清液。采用3 ml完全培养液（RPMI 1640，10%FBS）重悬，加入3 ml淋巴细胞分离液，于室温下2 000 r/min离心15 min，吸取中间絮状层和下层粒细胞层加入6 ml 完全培养液，1 800 r/min 离心 7 min，弃上清液。1 ml完全培养液重悬，计数后用于流式细胞仪检测。

3.颈部引流淋巴结细胞获取：处死小鼠后沿腹中线剪开小鼠皮肤直至下颌，取小鼠颈部淋巴结左右各 3 个置于 RPMI 1640 完全培养液，2 ml 针筒内芯研磨后通过 40 μm 无菌细胞筛，1 500 r/min 离心5 min，弃上清液。1 ml 完全培养液重悬，计数后用于流式细胞仪检测。

4.流式细胞仪检测中性粒细胞比例：皮肤细胞悬液中取1×106个细胞，加入1ml PBS，1 500 r/min离心5 min，弃上清液。加入2 μl Fc-block 4 ℃孵育10 min。加入 Viability Dye-APC/cy7、CD45-FITC、Gr1-APC、CD11b-PE/cy7，4 ℃避光孵育20 min，加入1 ml PBS，1 500 r/min 离心 5 min，弃上清液。加入100 μl PBS 重悬后于流式细胞仪检测中性粒细胞比例。

5.流式细胞仪检测皮肤细胞中CD3+T、γδT细胞比例及淋巴结细胞中CLA、S1P1 的表达：皮肤细胞悬液或淋巴结细胞中取1×106个细胞，加入1 ml PBS，1 500 r/min离心5 min弃上清液。加入2 μl Fcblock 4 ℃孵育10 min。加入Viability Dye-APC/cy7、CD3-Percp/cy5.5、γδ-PE-cy7、CLA-PE、S1P1-APC，4 ℃避光孵育20 min，加入1 ml PBS，1 500 r/min 离心5 min，弃上清液。加入100 μl PBS 重悬后FACS CantoⅠ检测 CD3+T、γδT 细胞比例及 CLA、S1P1表达。

6.流式细胞仪检测CD3+T、γδT 细胞中IL-17+细胞比例：皮肤细胞悬液或淋巴结细胞悬液中取2×106个细胞，加入24孔培养板中，加入完全培养基补足至1 ml，皮肤细胞悬液加入Golgiplug 1 μl，37 ℃，5% CO2培养箱培养4 h 后收集细胞至流式管。1 500 r/min 离心 5 min，弃上清液。加入2 μl Fc-block 4 ℃孵育10 min。加入CD3-Percp/cy5.5、γδ-APC、Viability Dye- APC/cy7、IL-17-PE/cy7 4 ℃孵育20 min。加入1 ml PBS 1 500 r/min离心5 min。尽量弃上清液后加入 400 μl 固定/破膜（Fixation/Permeabilization）工作液400 μl，室温20 min。加入1 ml 1× 洗液1 500 r/min 离心5 min，弃上清液，重复2 次。样本管加入IL-17-PE/cy7，同型对照管中加入相对应的同型对照，4 ℃冰箱孵育至少45 min。1 ml 1×洗液1 500 r/min离心5 min，弃上清液。加入100 μl 1 × 洗液重悬后流式细胞仪检测IL-17+CD3+T、γδT细胞的比例。所有流式结果应用Flow J软件分析。

四、统计学方法

采用Graphpad Prism 6.0软件，计量资料以±s表示，数据中符合正态分布的资料用t检验，不符合正态分布采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、FTY720 对银屑病小鼠耳朵皮肤组织学的影响

D2 时实验组小鼠耳厚度明显低于对照组（t=4.23，P＜ 0.01），直至D7 实验组小鼠耳厚度均低于对照组（P＜ 0.01）。见图1。

小鼠耳组织切片HE 染色显示，实验组小鼠耳表皮厚度（18.62 μm ± 0.19 μm）低于对照组（27.79 μm ± 1.58 μm），t= 4.35，P＜ 0.01（图 2A）。免疫荧光染色显示，实验组小鼠耳组织中性粒细胞浸润程度低于对照组（图2B）。流式细胞仪检测小鼠耳组织中性粒细胞比例。结果显示，实验组中性粒细胞比例（1.57%±0.12%）低于对照组（3.03%±0.33%），t=3.31，P=0.016（图2C）。

二、FTY720对银屑病小鼠耳皮肤细胞、颈部引流淋巴结细胞中细胞比例的影响

流式结果显示，实验组小鼠皮肤中CD3+、γδT细胞比例均低于对照组（t= 3.98、2.75，P＜ 0.05），见图3，CD3+细胞、γδT 细胞中IL-17+细胞比例亦均低于对照组（t= 6.89、10.27，P＜ 0.001），αβT 细胞中IL-17+细胞比例与对照组差异无统计学意义（t=0.184，P= 0.86），见图4。引流淋巴结中，实验组γδT 细胞比例高于对照组（t= 5.781，P= 0.001），γδT 细胞中IL-17+细胞比例亦高于对照组（t=4.140，P=0.006），见图5。

图1 C57BL/6 小鼠耳涂抹咪喹莫特（IMQ）后腹腔注射FTY720 对耳厚度的影响 实验组n=3；对照组n=5。a：两组比较，P ＜ 0.01

三、FTY720对引流淋巴结中γδT细胞S1P1及CLA表达影响

流式结果显示，实验组γδT 细胞S1P1、CLA 平均荧光强度均低于对照组（t值分别为50.55、31.64，P＜ 0.000 1）。见图6。

讨 论

图2 FTY720 对咪喹莫特（IMQ）诱导银屑病小鼠耳皮肤组织的影响 2A：实验组小鼠耳组织表皮厚度低于对照组（HE×10）；2B：免疫荧光染色显示，实验组小鼠耳组织中性粒细胞浸润程度低于对照组（图中比例尺单位为50 μm）；2C：流式细胞仪检测小鼠耳组织细胞中中性粒细胞比例

图3 流式细胞仪检测咪喹莫特（IMQ）诱导及腹腔注射FTY720后C57BL/6小鼠耳皮肤CD3+、γδT细胞比例 a：两组比较，P ＜0.05

图4 流式细胞仪检测咪喹莫特（IMQ）诱导及腹腔注射FTY720后C57BL/6小鼠耳皮肤CD3+细胞、γδT、αβT细胞中IL-17+细胞比例 两组比较，a：P ＜ 0.05，b：P ＞ 0.05

图5 流式细胞仪检测咪喹莫特（IMQ）诱导及腹腔注射FTY720后C57BL/6小鼠引流淋巴结中γδT细胞及IL-17+γδT细胞比例 a：两组比较，P ＜ 0.05

图6 流式细胞仪检测咪喹莫特（IMQ）诱导及腹腔注射FTY720后C57BL/6小鼠引流淋巴结中 γδT 细胞S1P1、CLA 平均荧光强度 实验组γδT 细胞S1P1、CLA 平均荧光强度均低于对照组（P ＜ 0.001）

银屑病是一种机制未明的炎症性皮肤病，抑制炎症细胞浸润、控制炎症因子产生及进行免疫调节是当前银屑病治疗的主要策略[9]。目前针对IL-17及其受体的生物治疗在治疗银屑病中已取得良好效果[10]。由于S1P1在细胞迁移浸润中发挥重要作用[11]，提示FTY720可通过抑制S1P1的表达减少炎症细胞的浸润以达到缓解银屑病的目的。本研究显示，FTY720 的使用可以显著缓解银屑病小鼠皮肤增厚，降低表皮厚度，减少中性粒细胞浸润，并降低皮肤中T细胞分泌IL-17水平，表明FTY720可以显著缓解小鼠银屑病临床症状且能降低主要致炎因子IL-17的水平。既往研究表明，IL-23皮内注射或IMQ局部涂抹诱导的小鼠银屑病模型中，真皮层中的γδT细胞是分泌IL-17的最主要细胞[12]。本研究采用IMQ诱导小鼠银屑病模型也发现，分泌IL-17的主要细胞是γδT 细胞，且FTY720 可显著降低γδT细胞分泌IL-17水平，提示FTY720通过降低分泌IL-17 的γδT细胞来缓解银屑病的症状。

S1P 与表达于多种免疫细胞上的S1P 1 ～5 结合以介导细胞迁移[13]。研究表明，FTY720 能通过抑制S1P1表达抑制特异性免疫细胞αβT细胞由淋巴结迁出，进而显著降低其在血液循环中的数量[14]，降低炎症因子的分泌[5，15]。FTY720在小鼠脑梗死模型中也有很好的治疗效果，可能的机制在于其能有效抑制γδT 细胞在脑部病灶的浸润[16]。但是γδT 细胞是否也是通过S1P1进行迁移以及被抑制的γδT细胞去向如何均报道较少。本研究发现，FTY720 处理组 γδT 细胞表达 S1P1 显著下调，引流淋巴结中γδT、IL-17+γδT 细胞比例明显升高，而皮肤组织中γδT、IL-17+γδT 细胞均明显减少，提示抑制 γδT 细胞 S1P1 的表达可将 γδT 细胞限制于引流淋巴结而减少其在皮肤组织中的比例。而FTY720显著下调引流淋巴结γδT 表面CLA 表达，也提示γδT细胞归巢至皮肤组织能力降低。

本研究显示FTY720的使用升高引流淋巴结中γδT 细胞比例，同时降低其在皮肤中的比例，提示FTY720可能有抑制引流淋巴结中γδT细胞向皮肤浸润的能力，随后我们将进一步对此观点进行验证。IMQ 诱导的小鼠银屑病模型尽管是目前研究银屑病最为广泛的动物模型，但不能完全代替人发生的银屑病，因此研究FTY720 对人银屑病的治疗效应及分子机制将是我们接下来工作的方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突