盐酸左西替利嗪对人毛乳头细胞生长影响的初步研究

韦菊梅 温斯健 包家娟 庄晓晟 林有坤

广西医科大学第一附属医院皮肤科，南宁 530022

雄激素性秃发（androgenetic alopecia，AGA）是一种雄激素依赖的、多种基因和环境因素共同作用的遗传性疾病。目前临床上用于AGA治疗最有效的药物是非那雄胺和米诺地尔，但前者有影响男性性功能的潜在不良反应，后者会发生多毛症、接触性皮炎、头痛和低血压等不良反应[1]。国外的一项研究发现，AGA 患者秃发区局部外用1%西替利嗪后毛发的总密度显著增加，而毳毛的密度明显降低[2]。前列腺素（prostaglandin，PG）具有介导细胞增殖、分化及凋亡等多种机体生理功能，广泛存在于各组织和体液中。在环氧化酶（COX）作用下，花生四烯酸转变为不稳定的前列腺素H2，然后通过相应的酶进一步加工为各种有生物活性的前列腺素，包括前列腺素 D2（PGD2）、PGE2、PGF2α 和PGI2等。通过比较不同亚型的前列腺素对头发生长的影响，发现PGE2 和PGF2α 可促进毛发生长，而PGD2则能抑制毛发生长，加剧毛囊微型化的发生[3]。研究证实，盐酸左西替利嗪通过与COX-2结合抑制其促前列腺素表达的能力[4]。我们通过研究盐酸左西替利嗪对人毛乳头细胞生长、增殖以及PG 相关信号因子表达的影响，初步探讨其影响毛发生长的作用及其分子机制。

材料和方法

一、主要试剂与仪器

高糖DMEM 培养基、胎牛血清（美国gibco 公司）。盐酸左西替利嗪原药粉剂（重庆华邦制药有限公司）、兔抗人α 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（美国PTGlab公司）、Cy3标记的山羊抗兔IgG（IgGCy3，上海碧云天生物技术有限公司）、四甲基偶氮唑蓝（MTT，美国sigma 公司）。细胞RNA、小分子RNA、DNA 和蛋白质共提取试剂盒（美国Magan 公司）、逆转录及荧光定量PCR 试剂盒（日本TAKARA公司）、BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。小鼠单克隆肌动蛋白抗体、山羊抗小鼠IgG、前列腺素D2合酶（PTGDS）兔单克隆抗体、山羊抗兔IgG（美国abcam公司）。PGD2酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）、PGD2 受体ELISA 试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司）。酶标仪（美国Thermo公司）、荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）、凝胶成像分析系统（美国GE公司）。

二、方法

1.细胞培养：人毛乳头细胞（human dermal papilla cells，hDPC）系（德国Promocell 公司）解冻复苏后加入含15%胎牛血清的高糖DMEM培养基（简称15% DMEM 条件培养基），于培养箱（37 ℃、5%CO2，培养条件下同）中培养24 h 后，视培养情况隔1 ～2 天换液1 次，细胞汇合至80%时传代、冻存。取冻存细胞复苏、培养，第2代hDPC细胞消化后用于以下实验。

2.免疫荧光观察hDPC 的生长情况：hDPC 细胞以1.5×105/孔接种于6孔板，每孔加15%DMEM条件培养液2 ml，细胞贴壁后换用含有0（对照组）、1、10、100、1 000、10 000 μg/L 盐酸左西替利嗪的15%DMEM条件培养液[5]培养48 h。细胞爬片后用含吐温20的磷酸盐缓冲溶液（PBST）浸洗，4%多聚甲醛固定，1%BSA封闭，兔抗人α-SMA抗体4 ℃湿盒内过夜，PBST 浸洗，加入IgG-Cy3 室温避光孵育1 h，DAPI染核，荧光显微镜下观察。实验重复3次。

3.MTT 测定细胞增殖率：hDPC 细胞1 × 104/孔接种于96 孔板，每孔加15%DMEM 条件培养液200 μl，细胞贴壁后换用含有0（对照组）、1、10、50、100、250、500、1 000、10 000、100 000 μg/L盐酸左西替利嗪的15%DMEM条件培养液培养48 h，设置调零孔，每浓度设5 个复孔。后予PBST 洗2 次，再加入含有MTT 的无血清DMEM 培养液，37 ℃孵育4 h 后，每孔加150 μl 二甲基亚砜，避光，低速振荡10 min，于490 nm 波长测吸光度（A值）。实验重复3次，取均值。细胞增殖率（%）=（实验孔A值-调零孔A值）（/对照组A值-调零孔A值）×100%。

4.实时荧光定量 PCR 检测 COX-2、PGE2、PGF2α、PTGDS、G 蛋白偶联受体44（GPR44）、蛋白激酶B（AKT）、糖原合成激酶3β（GSK3β）mRNA 的表达：hDPC细胞以1.5×105/孔接种于6孔板，每孔加15%DMEM条件培养液2 ml，细胞贴壁后换用含有0（对照组）、1、10、100、1 000、10 000 μg/L盐酸左西替利嗪的DMEM 培养液培养48 h。弃上清液后按细胞RNA、小分子RNA、DNA和蛋白质共提取试剂盒操作步骤分别提取细胞总RNA和总蛋白质。

（1）mRNA 表达水平检测：总RNA 采用反转录试剂盒合成cDNA 模板，目的基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。荧光定量PCR按试剂盒说明书操作，反应体系为20 μl，95 ℃预变性3 min，95 ℃变性3 s，60 ℃退火延伸30 s，共45 个循环。反应结束后分析扩增曲线，以β 肌动蛋白基因为内参，采用2-ΔΔCt法计算mRNA 的相对表达，实验重复3 次。实验组ΔCt=实验组Ct值 - 内参 Ct 值，对照组 ΔCt = 对照组 Ct 值 - 内参Ct值，ΔΔCt= 实验组ΔCt- 对照组ΔCt。

（2）Western印迹法检测PTGDS的蛋白水平：取提取的总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。1%牛血清白蛋白（BSA）封闭1.5 h后，加入相应的肌动蛋白抗体、PTGDS抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h。凝胶成像系统成像。实验重复3次。

5.ELISA 法检测 hDPC 培养上清液中 PGD2 和PGD2R水平：hDPC细胞以2×105/孔接种于6孔板，每孔加15%DMEM条件培养液2 ml，细胞贴壁后换用含有0（对照组）、1、10、100、1 000、10 000 μg/L盐酸左西替利嗪的无血清DMEM培养液培养24 h，采集细胞培养液，3 000 r/min，离心5 min（离心半径8 cm），取上清液，按试剂盒说明书操作，测定PGD2和PGD2R水平。实验重复3次。

三、统计学分析

采用SPSS17.0 软件，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、免疫荧光观察hDPC的生长情况

100 μg/L 组细胞生长良好，排列紧密，胞质丰富，融合度超过90%。对照组细胞融合度约70%～80%；10 000 μg/L组细胞稀疏，数量减少，细胞间连接不紧密，融合度不到60%。见图1。

表1 目的基因引物序列

图1 免疫荧光观察不同浓度盐酸左西替利嗪对人毛乳头细胞生长的影响（α-SMA染色×40）

二、盐酸左西替利嗪对hDPC增殖的影响

MTT 结果显示，不同浓度盐酸左西替利嗪组hDPC细胞的增殖率差异有统计学意义（F=42.22，P＜ 0.05），10、50、100、250、500 μg/L 组高于对照组（t值分别为 5.31、12.68、28.26、32.43、13.01，均P＜0.05），1、1 000 μg/L 组与对照组差异无统计学意义（t值分别为 0.11、0.66，均P＞ 0.05），10 000、100 000 μg/L 组低于对照组（t值分别为 143.95、161.26，均P＜ 0.05）。见图2。

图2 盐酸左西替利嗪对人毛乳头细胞体外培养增殖的影响1 ～ 10：分别为0、1、10、50、100、250、500、1 000、10 000、100 000 μg/L盐酸左西替利嗪。a：与对照组比较，P ＜0.05

三、盐酸左西替利嗪对COX-2、PGE2、PGFα、PTGDS、GPR44、AKT、GSK3β mRNA 表达及PGD2、PGD2R水平的影响

不同浓度盐酸左西替利嗪组的COX-2、PGF22、PTGDS、GPR44、AKT mRNA 表达差异均有统计学意义（P＜ 0.05），100 μg/L组COX-2、PTGDS、GPR44 表达低于对照组（t值分别为 1.97、2.17、2.66，均P＜ 0.05），PGF2α、AKT 的表达高于对照组（t值分别为3.66、7.32，均P＜ 0.05）。不同浓度盐酸左西替利嗪组的PGE2、GSK3β 表达差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见表2。

四、盐酸左西替利嗪对hDPC PTGDS蛋白水平的影响

不同浓度盐酸左西替利嗪组PTGDS 蛋白水平差异有统计学意义（P＜0.05），各浓度组均低于对照组（t值分别为 11.58、12.54、5.67、8.42、8.16，均P＜ 0.05）。见表2、图3。

五、盐酸左西替利嗪对hDPC PGD2和PGD2受体分泌的影响

ELISA 法结果显示，不同浓度盐酸左西替利嗪组hDPC 细胞培养上清液中的PGD2 和PGD2 受体水平差异均有统计学意义（均P＜0.05）。10 ～10 000 μg/L 组PGD2、PGD2R 蛋白水平明显低于对照组（t值分别为 20.75、45.07、87.09、101.62 和46.72、92.05、90.67、83.16，均P＜ 0.05），1 μg/L组与对照组相比差异无统计学意义（t值分别为0.26、1.72，P＞ 0.05）。见表3。

表2 不同浓度盐酸左西替利嗪处理对人毛乳头细胞相关基因mRNA、蛋白水平的影响（±s）

表2 不同浓度盐酸左西替利嗪处理对人毛乳头细胞相关基因mRNA、蛋白水平的影响（±s）

注：n=3。COX-2：环氧化酶2；PGE2：前列腺素E2；PGF2α：前列腺素F2α；PTGDS：前列腺素D2合酶；GPR44：G蛋白偶联受体44；AKT：蛋白激酶B；GSK3β：糖原合成激酶3β。PTGDS蛋白水平检测采用Western印迹法。a 与对照组相比，P ＜0.05

盐酸左西替利嗪浓度0（对照组）1 μg/L 10 μg/L 100 μg/L 1 000 μg/L 10 000 μg/L F值P值mRNA水平（2-ΔΔCt）PTGDS蛋白COX-2 1 0.97±0.09 0.90±0.10 0.84±0.08a 1.05±0.11 1.13±0.09 1.97 0.028 PGE2 1 1.09±0.21 0.88±0.10 0.96±0.14 1.27±0.44 1.12±0.20 0.87 0.399 PGF2α 1 1.66±0.22a 1.65±0.14a 1.96±0.25a 1.61±0.16a 1.51±0.59 3.66 0.034 PTGDS 1 0.96±0.08 0.83±0.09a 0.81±0.10a 0.86±0.08a 0.99±0.11 2.17 0.045 GPR44 1 1.07±0.12 0.98±0.02 0.85±0.09a 1.02±0.05 1.05±0.08 2.66 0.042 AKT 1 1.35±0.09a 1.66±0.19a 1.74±0.32a 1.60±0.24a 1.78±0.11a 7.32 0.002 GSK3β 1 0.99±0.08 0.93±0.08 0.90±0.06 0.85±0.95 0.81±0.09 1.19 0.371 0.73±0.06 0.50±0.04a 0.54±0.09a 0.32±0.05a 0.43±0.05a 0.44±0.10a 11.84＜0.05

讨 论

研究发现，位于毛囊基底部的毛乳头细胞可诱导上皮细胞增殖分化形成毛囊，调控毛发生长周期，在AGA 的发生和发展中发挥着重要的作用[6]。Garza 等[7]证实，AGA 患者秃发区 PTGDS 与 PGD2的mRNA和蛋白质水平同时升高，尤其是当毛囊毛发处于生长期向退行期转变时，变化更为明显，PGD2 局部外用于移植人毛囊的小鼠，能够抑制GPR44，使毛囊微型化，导致小鼠的毛发稀疏、脱落[8]。PGD2 是重要的炎症调节分子，主要通过与PTGDR 和GPR44 相互作用而发挥生物学效应[9-10]。作为PGD2的受体，GPR44不仅表达于毛囊外根鞘内，还表达于外鞘区的真皮毛乳头中[11-12]。此外，在小鼠模型上过表达COX-2，同样会出现脱发的情况[13]。国外已有使用PTGDS 抑制剂治疗AGA 报道[14]。这些证据提示，前列腺素参与了毛发生长过程，且有可能成为脱发疾病新的靶向治疗位点。Charlesworth 等[15]发现，西替利嗪不仅能抑制炎症细胞浸润，还能明显降低PGD2的表达。盐酸左西替利嗪通过与COX-2结合，降低前列腺素的表达水平[3]，这些效应与它们的抗组胺活性无关。Jeong 等[16]发现，PGD2 通过调控 hDPC 上的 DP2 和AKT 信号通路，引起雄激素受体活化，进而导致TGFβ1、Creb、LEF1 和 IGF-1 等毛发生长抑制因子的产生。AKT信号通路可激活下游靶蛋白基因，促进毛囊干细胞的增殖，参与毛乳头细胞的增殖、分化，在调控毛囊的发育和再生中发挥重要作用[17]。截止目前，尚无盐酸左西替利嗪对毛发生长调控分子机制的研究报道。基于此，我们利用hDPC 探讨了盐酸左西替利嗪与毛发生长的关系。

图3 不同浓度（μg/L）盐酸左西替利嗪处理人毛乳头细胞细胞前列腺素D2合酶蛋白水平

表3 不同浓度盐酸左西替利嗪对人毛乳头细胞培养上清液中前列腺素D2、前列腺素D2受体水平的影响（±s,ng/L）

表3 不同浓度盐酸左西替利嗪对人毛乳头细胞培养上清液中前列腺素D2、前列腺素D2受体水平的影响（±s,ng/L）

注：n=3。a 与对照组相比，P ＜ 0.05

盐酸左西替利嗪浓度0（对照组）1 μg/L 10 μg/L 100 μg/L 1 000 μg/L 10 000 μg/L F值P值前列腺素D2 180.08±6.15 178.15±2.72 158.92±2.72a 141.62±5.44a 126.23±4.57a 124.31±4.84a 66.15＜0.01前列腺素D2受体273.24±3.18 265.74±7.42 237.58±7.96a 215.08±9.55a 188.82±12.20a 181.95±13.79a 44.33＜0.01

本研究显示，盐酸左西替利嗪可明显促进hDPC 的增殖，而且在100 μg/L 浓度时细胞生长良好、增殖率明显升高。实时定量PCR 结果显示，100 μg/L 盐酸左西替利嗪能明显抑制COX-2、PTGDS、GPR44 mRNA 的 表 达 ，同 时 促 进 AKT mRNA的表达。Western印迹法及ELASA法结果同样显示，盐酸左西替利嗪能降低PTGDS、PGD2及其受体的蛋白表达水平。这些结果提示，盐酸左西替利嗪可能通过抑制PGD2-GPR44通路，激活AKT信号通路，促进体外培养hDPC的生长、增殖。本研究还发现，盐酸左西替利嗪能促进PGF2α 的表达，但并未对PGE2 的表达产生影响，二者虽同为前列腺素，但对毛发生长的作用却与PGD2的相反。2009年美国食品药品监督管理局（FDA）批准临床上可常规使用PGF2α 的类似物拉坦普罗斯特促进人睫毛生长[18]，PGE2 也被证实可改善经辐射诱导的小鼠脱毛[19]。目前实验尚未涉及AKT 下游信号转导通路以及PGF2α 调控机制的研究。而且，在活体复杂条件下，盐酸左西替利嗪对PGD2- GPR44 的调控规律也待进一步研究。

综上，本实验以盐酸左西替利嗪作为干预因素，证明盐酸左西替利嗪能促进hDPC 的生长、增殖，还可明显抑制PGD2-GPR44 通道上相关因子COX-2、PTGDS、PGD2、PGD2R、GPR44 的表达，并初步探讨了AKT 信号通路在该过程中所起的作用，为盐酸左西替利嗪治疗雄激素性秃发提供了实验和理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突