体外低浓度过氧化氢对人黑素细胞自噬水平的影响及自噬相关lncRNA的筛选

石家绮 李雪 孙利 赵文娥 丁书红 侯晓媛 修艳燕 鲁严

1南京医科大学第一附属医院皮肤科 210029；2南京医科大学附属妇产医院皮肤科210004；3南京医科大学分析测试中心电镜室 210000

白癜风是一种后天性皮肤色素脱失性疾病，特点为表皮及毛囊中黑素细胞大量丧失[1]。研究[2]表明，白癜风患者存在表皮内以及系统性H2O2水平增高的现象，正常人体内细胞信号传导和转录需要约10-6mol/L 浓度的H2O2，而白癜风患者表皮H2O2浓度则高达10-3mol/L。Yao 等[3]提出，白癜风患者在发病初期表皮内H2O2可呈低浓度，虽不足以杀死黑素细胞，但会影响细胞功能，进而引发炎症及自身免疫反应。2003年，Gauthier等[4]提出了“黑素细胞经表皮脱失理论”，即白癜风中黑素细胞的丢失可能是黑素细胞固有的黏附缺陷和外在机械性损伤等所致。Benzekri 等[5]发现，白癜风患者存在表皮黑素细胞与周围角质形成细胞间的黏附障碍，并且部分角质形成细胞损伤及功能障碍会促进受到机械性损伤或氧化应激的黑素细胞脱失。我们在前期研究中已成功用400 μmol/L H2O2诱导黑素细胞提前衰老[6]。在此基础上，我们进一步探讨提前衰老的黑素细胞黏附功能及自噬水平的变化，并通过基因芯片筛选正常黑素细胞及提前衰老的黑素细胞中差异表达的自噬相关长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA），预测其可能的作用机制。

材料和方法

一、主要试剂及仪器

Ham F12培养基、胎牛血清（美国Gibco公司），Dispase酶（德国Roche公司），胰蛋白酶、青霉素-链霉素溶液、CCK8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）、遗传霉素（G418）（美国Sigma 公司），H2O2溶液（南京化学试剂有限公司），TRIzol（美国Invitrogen公司），兔抗人E-钙黏素抗体、兔抗人β肌动蛋白抗体、兔抗人微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗 体（ 美 国 Cell Signaling Technology 公司），兔抗人SQSTM1/p62 抗体（英国Abcam 公司），山羊抗兔IgG 二抗（南京巴傲德生物科技有限公司），QIAGEN RNA 提取试剂盒、第一链缓冲液、PCR反应试剂（上海艾博思生物科技有限公司），流式细胞仪（美国Beckman Coulter有限公司）。

二、黑素细胞培养及实验分组

标本来自南京医科大学第一附属医院泌尿外科健康男性包皮环切术后获得的皮肤组织，已征得患者知情同意，并经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准同意（伦理审批号：2018-SRFA-056）。聚维酮碘浸泡包皮后，去除皮下组织，用0.25% DispaseⅡ在37 ℃下消化4 h 后行真表皮分离。表皮剪碎后胰酶消化、筛网过滤、离心后获得单细胞悬液，接种于含10%胎牛血清的F12 培养基，于5%CO2、37 ℃培养箱中培养24 h。然后，换液去除未贴壁细胞，并在培养基中加入100 mg/L G418 抑制成纤维细胞的生长。2 d 后换不含G418的培养基继续培养。细胞90%融合时，采用胰酶差别消化，培养瓶中加入胰酶在37 ℃培养箱中消化3 min，使黑素细胞脱离培养瓶壁，角质形成细胞仍紧密黏附于培养瓶壁，从而分离黑素细胞与角质形成细胞。黑素细胞液离心后用培养基重悬，继续传代培养。

本课题组前期实验已证实，400 μmol/L H2O2可诱导黑素细胞提前衰老[6]，本研究也选择该浓度处理黑素细胞。取对数生长期黑素细胞，分为3 组：①对照组，无H2O2处理；②H2O2组，400 μmol/L H2O2处理，每天更换 H2O2溶液 1 次；③H2O2+ NAC 组：4 mmol/L NAC预处理细胞2 h，然后加入400 μmol/L H2O2处理，每天更换NAC和H2O2溶液1次。处理5 d后，进行以下实验，每组实验均重复3次。

三、共聚焦显微镜观察H2O2处理后黑素细胞E-钙黏素、LC3及p62表达

各组黑素细胞处理5 d 后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次去除培养基。室温下4%多聚甲醛固定20 min，0.2%Triton X-100细胞破膜10 min，山羊抗兔血清封闭1 h，相应抗体（E-钙黏素抗体、LC3 抗体、p62 抗体的稀释比例或浓度分别为1∶200、1∶100、1 μg/ml）4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次，室温下避光孵育山羊抗兔IgG 二抗1 h，DAPI 荧光染料染核5 min，PBS 清洗3 次，共聚焦显微镜下观察并摄片。

四、透射电镜观察黑素细胞自噬小体

收集各组黑素细胞，离心获得细胞沉淀，加入预冷的2.5%戊二醛，4 ℃固定过夜，后PBS 洗涤3 次，1%锇酸固定2 h，PBS 洗涤3 次。使用梯度乙醇（50%、70%、80%、90%）各1次脱水，每次15 min，纯丙酮2次脱水，每次15 min。纯丙酮+包埋液（1∶1）中室温浸透过夜，切片机切成80 nm 超薄切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察并摄片。

五、Western印迹法检测LC3、p62蛋白表达

预冷PBS洗涤各组细胞3次，于冰上提取总蛋白，4 ℃离心机离心后吸去上清，加入5×上样缓冲液混匀后煮沸变性。蛋白经12%或10% SDSPAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。5%的脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，TBST缓冲液洗涤3次后，按抗体说明书稀释一抗（LC3、p62稀释比例分别为1∶1 000、1∶10 000），4 ℃孵育过夜，二抗（1∶10 000 稀释）室温摇床孵育1 h，经化学发光法显色。用ImageJ软件分析图片，计算E-钙黏素、p62 与β 肌动蛋白的灰度比值及LC3-Ⅰ与LC3-Ⅱ的灰度比值。

六、基因芯片分析

TRIzol 提取各组细胞总RNA，使用QIAGEN RNeasy®试剂盒纯化总RNA，反转录合成双链cDNA，进一步合成荧光探针Cy3 标记的cRNA，用QIAGEN RNeasy®微量试剂盒纯化cRNA 并测定其浓度。cRNA 片段化后加入杂交缓冲液，混匀后滴加于芯片上滚动杂交过夜。杂交完成后洗涤芯片并用Agilent G2505C 扫描仪（美国Agilent Technologies 公司）扫描得到原始图像，并用Feature Extraction 软件提取原始数据。Genespring软件用来进行分位数标准化及后续处理，miRNA靶基因预测软件TargetScan 对数据进行生物信息学分析，预测RNA的下游作用靶点。

七、统计学处理

使用Graphpad Prism 6软件进行统计分析。计量资料采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，并用Tukey 检验进行两两间的多重比较，P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、H2O2处理对黑素细胞中E-钙黏素表达的影响

图1 共聚焦显微镜观察H2O2处理黑素细胞后E-钙黏素的表达情况（×200） 对照组黑素细胞周围可见连续明亮绿色荧光，H2O2+NAC组荧光稍暗于对照组，H2O2组可见微弱荧光

共聚焦显微镜下可见对照组黑素细胞膜周围分布E-钙黏素的明亮绿色荧光，H2O2+NAC 组荧光稍暗于对照组，H2O2组荧光微弱，见图1。3组黑素细胞E-钙黏素荧光强度比较，差异有统计学意义（F=19.350，P＜ 0.01）；两两多重比较显示，H2O2组荧光强度（4.876 ± 0.165）显著低于对照组（16.840 ± 2.335，q=8.686，P＜ 0.01）及H2O2+NAC组（12.530 ± 0.467，q= 5.554，P＜ 0.01），对照组与H2O2+NAC组差异无统计学意义（q=3.132，P＞0.05）。

二、透射电镜下观察H2O2处理后黑素细胞中自噬小体

对照组黑素细胞胞质内大部分线粒体嵴排列尚整齐，可见数个自噬小体及电子密度高的黑素小体。H2O2组黑素细胞胞质内空泡明显增多，大部分线粒体见嵴断裂模糊，内质网扩张，胞质内黑色素颗粒较少，未见明显自噬小体。H2O2+NAC组黑素细胞胞质内线粒体嵴排列尚整齐，部分空泡，可见数个自噬小体。见图2。

三、H2O2处理降低黑素细胞自噬水平

共聚焦显微镜下，对照组及H2O2+ NAC 组的黑素细胞胞质内可见多个明亮的LC3点状荧光，而H2O2组黑素细胞内则未见LC3 点状荧光，见图3。相反，与对照组及H2O2+ NAC 组相比，H2O2组中p62荧光增多，见图4。Western印迹结果显示，3组黑素细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值及p62/β 肌动蛋白值差异均有统计学意义（F= 15.39、7.227，均P＜0.05）。两两多重比较显示，H2O2组黑素细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值（0.604±0.012）显著低于对照组（1.200±0.081，q=7.718，P＜ 0.01）及H2O2+NAC组（1.017 ±0.062，q=5.076，P＜ 0.05），同时其p62/β 肌动蛋白值（0.881±0.079）显著高于对照组（0.456±0.121，q= 4.847，P＜ 0.05）及 H2O2+ NAC 组（0.492 ±0.049，q=4.439，P＜ 0.05）。见图5。H2O2+NAC组与对照组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值及p62/β 肌动蛋白值差异无统计学意义（q=2.642和0.407，均P＞ 0.05）。

图2 透射电镜观察H2O2处理对黑素细胞超微结构的影响 2A（×30 000）：对照组，黑素细胞胞质内大部分线粒体嵴排列尚整齐，可见数个自噬小体及电子密度高的黑素小体；2B（×25 000）：H2O2组，黑素细胞胞质内空泡明显增多，大部分线粒体见嵴断裂模糊，内质网扩张，胞质内黑色素颗粒较少，未见明显自噬小体；2C（×25 000）：H2O2+NAC组，黑素细胞胞质内线粒体嵴排列尚整齐，部分空泡，可见数个自噬小体图中箭头标注为细胞胞质内自噬体

图3 共聚焦显微镜观察H2O2处理后黑素细胞微管相关蛋白1轻链3（LC3）表达情况（×400） 对照组及H2O2+NAC组的黑素细胞胞质内可见多个明亮的LC3点状荧光，而H2O2组黑素细胞内未见明显LC3点状荧光

图4 共聚焦显微镜观察H2O2处理后黑素细胞内p62表达情况（×400） 与对照组及H2O2+NAC组相比，H2O2组黑素细胞内p62点状荧光增多

四、基因芯片数据分析

通过生物信息学分析，从lncRNA 芯片结果中筛选出18 个差异表达的、且与黑素细胞提前衰老有关的自噬相关lncRNA，其中表达上调的lncRNA有11个，表达下调的有7个。进一步筛选出在提前衰老的黑素细胞中表达明显上调的自噬相关lncRNA NONHSAT190308.1（差异 ＞ 10 倍），见图6。靶基因预测软件TargetScan 预测其可与miRNA hsa-miR-361-3p 靶向结合，hsa-miR-361-3p 又靶向CDKN1A，CDKN1A即衰老相关蛋白p21。

讨 论

图5 Western 印迹法检测各处理组p62 及微管相关蛋白1 轻链3（LC3）表达 1：对照组；2：H2O2组；3：H2O2+NAC组

图6 基因芯片数据分析筛选差异表达的自噬相关长链非编码RNA（lncRNA） 生物信息学分析筛选出262 个自噬相关lncRNA（差异 ＞ 2倍，P ＜ 0.05），其中有18个lncRNA与黑素细胞提前衰老有关

越来越多的研究[2，7-9]表明，由 H2O2引起的氧化应激是白癜风发生发展的关键因素之一，细胞氧化还原平衡失调可能是白癜风的致病机制。Bellei等[10]提出，氧化应激可导致黑素细胞提前衰老，并在细胞和分子水平上表现出和退行性疾病相同的信号转导途径的改变，包括脂质代谢的改变、线粒体呼吸链的损伤、细胞内信号传导的功能障碍。“黑素细胞经表皮脱失理论”提出后便受到了广泛关注，该理论认为黑素细胞受损导致的黏附缺陷以及受到的外在机械损伤会导致其与角质形成细胞黏附受损，进而从表皮脱失，其本质与氧化应激密切相关[4]。我们前期通过电镜观察到白癜风患者皮损边缘黑素细胞树突缩短，部分黑素细胞甚至没有树突，致使其与周围角质形成细胞连接松散，从超微结构验证了黑素细胞经表皮脱失理论[11]。黑素细胞与角质形成细胞间的直接接触是黑素小体转运所必须的条件，E-钙黏素作为介导黑素细胞与角质形成细胞间黏附的主要介质，存在于整个细胞表面；在氧化应激状态下可在黑素细胞膜内呈不连续或不均匀分布或丢失，这种分布的改变先于白癜风皮损的发生，是白癜风发病机制中的早期事件[12]。前期实验[6]中我们已经从蛋白水平证实，H2O2处理后黑素细胞E-钙黏素表达较对照组显著下降。在本研究中，我们运用免疫荧光检测H2O2处理前后E-钙黏素的变化，发现与对照组细胞周围明亮的绿色荧光相比，H2O2组黑素细胞周围E-钙黏素荧光强度显著减弱，而H2O2+NAC 组细胞E-钙黏素荧光强度未有明显减弱。以上结果表明，H2O2诱导的提前衰老的黑素细胞存在黏附缺陷，与周围角质形成细胞黏附减弱，易经表皮脱失而发生白斑。

自噬是溶酶体降解过程，可以清除细胞内受损的细胞器和错误折叠的蛋白质，维持细胞稳态，促进细胞生长[13]。自噬的激活可以抑制由应激诱导的细胞衰老和延缓衰老，而自噬水平的降低或抑制则与衰老和提前衰老有关[14]。氧化应激环境可破坏细胞线粒体功能，线粒体是体内活性氧的主要来源场所，线粒体受损可促进活性氧的过度生成[15]，进而加速细胞衰老。本研究发现，H2O2组黑素细胞内线粒体数量减少，明显肿胀，嵴排列紊乱，而加入NAC 作为抗氧化剂的处理组大部分线粒体形态结构仍基本正常，仅存在微弱的线粒体损伤，证明氧化应激环境可使细胞线粒体出现形态异常，而形态异常则是线粒体功能受损的主要表现。线粒体受损后，则需要启动自噬过程来清除受损线粒体，自噬水平下降则会使损伤细胞器积聚，影响细胞功能。电镜下，与对照组相比，H2O2组黑素细胞内线粒体肿胀伴嵴断裂，未见明显的自噬体，与白癜风患者皮损边缘黑素细胞超微电镜观察结果基本一致[16]。蛋白水平上亦证实H2O2组黑素细胞LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化减少，同时p62 表达增加，而H2O2+NAC 组黑素细胞内可见较多自噬小体，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值高于H2O2组，表明抗氧化干预可缓解氧化应激对黑素细胞造成的自噬损伤。

2011年有学者提出了竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）假说[17]，即miRNAs 可通过序列互补与靶基因的miRNA 反应元件（miRNA response elements，MREs）互补结合，导致靶基因mRNA的降解或阻止靶基因的翻译，起到负性调节的作用。lncRNA 可作为一种ceRNA，通过“海绵”吸附的方式吸附miRNA，减弱miRNA对靶基因 mRNAs 的“沉默效应”，从而对 miRNA 的靶基因mRNAs 进行调控。本课题组前期实验[6]已证实，400 μmol/L H2O2可诱导黑素细胞提前衰老，且衰老相关蛋白p21、p53 表达增高。根据基因芯片结果及预测软件预测hsa-miR-361-3p 靶向CDKN1A（又被称为p21），我们预测自噬相关lncRNA NONHSAT190308.1 可能通过 MRE 竞争结合hsa-miR-361-3p，降低hsa-miR-361-3p的水平，减弱其对靶基因p21的“沉默效应”，从而可能使衰老相关蛋白p21的表达增多。

综合本研究结果和前期研究结果我们推测，氧化应激可使黑素细胞自噬水平显著下降，难以清除氧化应激压力下受损的细胞器，进而导致黑素细胞提前衰老，细胞树突缩短，与角质形成细胞连接疏松，传递黑素小体功能受损，黏附能力减弱，最终经表皮脱失。如能证实并明确自噬相关lncRNA NONHSAT190308.1在黑素细胞提前衰老中作用机制，则可通过降低衰老相关蛋白的表达，延缓黑素细胞在氧化应激环境下的提前衰老进程，维持黑素细胞黏附能力，进而减少黑素细胞经表皮脱失，调控白癜风的发生和发展。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突