带状疱疹神经痛全基因组及GCH1基因甲基化差异变化研究

杨肖肖 郑娜娜 钟连生 潘志强 郁泽宇

1 徐州医科大学附属医院皮肤性病科 221002；2 徐州医科大学麻醉学重点实验室221002；3徐州医科大学形态学科研实验中心 221002

神经痛是带状疱疹最重要且严重的症状之一，主要与神经系统受损有关，其发生发展机制尚未完全明确。疼痛相关基因表达变化则是疼痛发生的根本原因，而表观遗传修饰则是调控基因表达的重要因素[1]。常见的表观遗传修饰有DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA 调控等[2]。DNA 甲基化是在转录水平调控基因表达的表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl transferases，DNMTs）催化CpG 岛的第5 位胞嘧啶（5C）生成5 甲基胞嘧啶（5mC）[3]。DNA 甲基化修饰可调控疼痛相关基因的表达，与疼痛发生发展密切相关[4-5]。GCH1基因是近年来发现的与神经病理性疼痛关系较为密切的基因，参与调控机体多个系统的生理和病理过程。本研究以带状疱疹神经痛患者为研究对象，初步探讨全基因组以及GCH1 基因甲基化修饰是否与带状疱疹神经痛发生相关。

对象与方法

1.病例来源：选择2017年6-10月在徐州医科大学附属医院皮肤科确诊为带状疱疹的患者36例，均有明显神经痛症状，疼痛程度以影响睡眠为标准。所有患者均给予静脉滴注阿昔洛韦抗病毒、口服甲钴胺营养神经及外用炉甘石洗剂治疗，如有继发细菌感染则外用夫西地酸乳膏抗感染，且均未使用加巴喷丁等止痛药物，治疗后疼痛完全缓解者（不影响正常睡眠）方能入组。所有患者均无其他伴有疼痛症状的疾病及神经系统相关的疾病，如肌张力障碍、阿尔兹海默症、帕金森病等，无严重心、肝、肾等系统性疾病。36 例患者中男21 例，女15例，年龄（65.14±1.57）岁，从发病到治疗前血样采集时间为（4.61±0.26）d，从发病到治疗后血样采集时间为（3.03±2.26）d。选择同期于本院体检、年龄和性别具有可比性的健康人36例作为对照组，其中男20例，女16例，年龄（63.39± 1.62）岁。抽取患者治疗前、经治疗疼痛完全缓解后及健康体检者外周血液2 ml 于无核酶的EP 管中，-80 ℃冰箱保存。本实验获得徐州医科大学附属医院伦理委员会批准（伦理审批文号：XYFY2018-KL031-01），所有受试者均签署知情同意书，自愿加入本研究。

2.主要试剂及仪器：基因组DNA 提取试剂盒（上海赛百盛基因技术有限公司），甲基化DNA 富集（IP）试剂盒（美国Zymo Research 公司），定量PCR 引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]，SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒（日本Takara 公司），鼠抗5mC 单克隆抗体（美国Active Motif 公司），辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠二抗（上海碧云天生物技术有限公司南通分公司）。非接触式超声破碎仪Bioruptor（比利时Diagenode 公司），NanoDrop 2000核酸浓度测定仪（美国Thermo公司）。

3.血液DNA 提取：采用上海赛百盛基因技术有限公司树脂型基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，严格按照说明书操作。

4.斑点杂交法（dot-blot）检测全基因组甲基化水平：采用核酸浓度测定仪分别测出每组DNA 浓度，将每组DNA配制为等浓度；取300 ng DNA加入0.1 mol/L氢氧化钠3 μl和灭菌水配成14 μl体系混合液；PCR 仪上 99 ℃ 5 min 处理后，冰浴 2 min，加入6.6 mol/L醋酸铵1 μl，配制成15 μl体系；各组取5 μl 在尼龙膜上点样，紫外交联10 min；置入封闭液中封闭4 h；加入鼠抗5mC 一抗（1∶5 000 稀释）4 ℃孵育过夜；第2天复温30 min后用1×TBS漂洗3 次，每次5 min；加入辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠二抗（1∶1 000稀释）37 ℃孵育2 h后漂洗3次，每次5 min；加入电化学发光（ECL）液，凝胶成像仪曝光。扫描条带，用ImageJ 分析灰度值用于半定量分析。

5.GCH1基因甲基化水平检测：

（1）全基因组DNA片段化：使用非接触式全自动超声破碎仪Bioruptor破碎基因组DNA，冷却超声波水槽；将 100 μl DNA 置于 1.5 ml EP 管；每次 6 个样本，每个样本持续30 min；取2 μl 超声后的DNA进行电泳检测，超声后小于500 bp 片段化DNA 即下游实验所需。

（2）GCH1 基因甲基化DNA 富集：采用甲基化DNA 富集试剂盒。取160 ng DNA，加入DNA 变性缓冲液配成50 μl 体系，98 ℃，5 min，变性；待变性后的DNA与250 μl MIP缓冲液、15 μl Zymo磁珠蛋白A、1.6 μl鼠抗5mC单克隆抗体混合物混匀，37 ℃孵育1 h；500 μl MIP 缓冲液洗涤磁珠，弃废液，重复该操作1 次；500 μl DNA 洗脱缓冲液洗涤磁珠，弃废液；15 μl DNA 洗脱缓冲液重悬磁珠，PCR 仪75 ℃孵育5 min 后，置于磁力架上2 min，收集液体即为DNA，-20 ℃冰箱保存待用。

（3）GCH1 基因甲基化富集定量PCR 扩增：针对GCH1 基因启动子CpG 含量较高区域（-490 ～273）设计扩增引物，正向引物：5′-CCAAGAGTCTG AAGTCACATT-3′，反向引物：5′-CAGGAGCTGGGA TCTCAGTG-3′，目标片段大小为217 bp。定量PCR扩增等质量 DNA，反应体系 10 μl，包括 SYBR Premix 及GCH1 基因启动子区特异扩增引物。反应条件：94 ℃预变性1 min，94 ℃变性15 s，54 ℃退火42 s，72 ℃延伸43 s，45 个循环。每个样本重复3 次。相对表达量（RQ）= 2-ΔΔCT，△△Ct=（实验组output DNA Ct 值 - 实验组input DNA Ct 值）-（对照组 output DNA Ct 值 - 对照组 input DNA Ct 值），input DNA 为甲基化试剂盒处理前，output DNA 为甲基化试剂盒处理后。

6.统计与分析：采用 GraphPad Prism v7.00 软件对实验数据进行统计分析，并生成统计图表。计量资料均采用±s表示，带状疱疹患者治疗前后比较采用配对t检验，患者组与健康对照组比较采用两独立样本t检验，检验水准α=0.05。

结 果

1.全基因组甲基化水平检测结果：患者治疗前组、治疗后组及健康对照组全基因组甲基化相对水平（5mC 灰度值）分别为 135.94 ± 2.52、144.76 ±3.48、146.84±3.39，治疗前组显著低于健康对照组（t= 2.580，P＜ 0.05）和治疗后组（配对t= 2.056，P＜0.05），而后两组相比差异无统计学意义（t=0.429，P＞ 0.05）。见图1。

2.GCH1基因甲基化定量PCR 结果：荧光定量PCR 扩增曲线显示，甲基化试剂盒处理前，治疗前后及健康对照组PCR 扩增CT 值无显著差异；甲基化试剂盒处理后，与治疗后及健康对照组相比，治疗前组扩增CT 值显著增加。扩增产物经1.6%琼脂糖凝胶电泳，得到大小217 bp 的目标条带（图2）。荧光定量PCR 结果统计分析表明，治疗前组、治疗后组及健康对照组GCH1 基因甲基化相对水平分别为0.65±0.17、0.89±0.13 和0.97±0.07，治疗前组显著低于健康对照组（t=4.648，P＜ 0.01）和治疗后组（配对t=3.977，P＜ 0.05），而后两组差异无统计学意义（t=0.506，P＞ 0.05）。见图3。

讨 论

图1 带状疱疹神经痛患者组治疗前后全基因组甲基化相对水平（5mC灰度值） 治疗前患者组全基因组甲基化水平低于健康对照组和治疗后组。a：P ＜0.05

图2 带状疱疹神经痛患者组治疗前后GCH1基因启动子甲基化定量 PCR 产物电泳图 M 为 DL500 DNA Marker ，1、4 为健康对照组，2、5为治疗前组，3、6为治疗后组，7为空白对照；1 ～ 3为甲基化试剂盒处理前，4 ～6为甲基化试剂盒处理后

图3 带状疱疹神经痛患者组治疗前后GCH1基因甲基化相对水平 治疗前GCH1 基因甲基化水平显著低于健康对照组和治疗后组。a：P ＜ 0.01，b：P ＜ 0.05

近年来研究表明[6]，疼痛的发生发展过程中表观遗传学发挥着重要调控作用，表观遗传是指DNA 序列不发生变化但基因表达受环境等因素的影响而发生可遗传的改变。神经病理性疼痛的产生和维持与疼痛相关基因的转录和表达水平密切相关[7-8]，而DNA 甲基化则是调控基因转录和表达水平的重要表观遗传修饰方式之一[3]。DNA 甲基化能通过引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变来调控基因的表达[9]。真核生物较为普遍的DNA 甲基化修饰是DNA胞嘧啶第5位碳原子（5C）的甲基化（5mC），它作为稳定的表观遗传标记常存在于CpG 或CPHPG（H = A,T,C）二核苷酸对，尤其是CpG 组成的 CpG 岛区域[3]。基因启动子或增强子 CpG 岛甲基化，导致DNA构象发生变化，影响蛋白质与DNA的相互作用，从而影响基因转录水平，并进一步调控细胞分化、胚胎发育和疾病的发生发展[10]。在糖尿病大鼠神经病理性疼痛模型[11]中，p2x3r 基因启动子区域甲基化水平降低，会导致P2X3R 过表达，从而加重神经疼痛症状。关于神经病理性疼痛发病机制的研究[12]中，神经结扎可诱导脊髓基因表达变化。脊髓神经结扎会导致Cxcr3基因甲基化水平降低，脊髓神经元中趋化因子受体CXCR3 表达增加，从而促进中枢敏化，促成神经性疼痛[13]。在损伤外周神经导致疼痛的动物模型中[14]，其脊髓内总甲基化水平升高，给予DNA甲基化抑制剂后，脊髓内DNA 甲基化水平降低，同时疼痛症状也有所缓解。上述研究提示，DNA 甲基化与神经病理性疼痛有密切的关系。

带状疱疹神经痛的发生与基因表达的变化密切相关，Jean 等[15]研究表明，在带状疱疹后遗神经痛小鼠模型中，水痘-带状疱疹病毒可诱导小鼠脊髓背根神经节84个基因表达上调，116个基因表达下调，从而导致小鼠疼痛行为的发生。于雪等[16]在带状疱疹后遗神经痛与HLA-A等位基因相关性的研究中发现，HLA-A*2601、HLA-A*3004、HLA-A*3303、HLA-A*0201 与中国北方汉族人群带状疱疹后遗神经痛发病相关，其中HLA-A*2601、HLA-A*3004、HLA-A*3303 为带状疱疹后遗神经痛发病的易感基因，而HLA-A*0201 为保护性基因。此外，有研究表明[8]，COMT、OPRM1、TRPV1、MC1R、GCH1 和CACNA2D3 等均属疼痛相关基因，其中GCH1 是与神经病理性疼痛发生发展较为密切的基因。梁啸等[17]在大鼠神经病理性疼痛动物实验模型中检测到大鼠背根神经节内GCH1 疼痛相关基因表达产物三磷酸鸟苷环化水解酶1（GTPCH1）表达增加。构建双向重组腺相关病毒rAAV-shGCH1 抑制 GCH1 的表达时[18]，小鼠背根神经节处GCH1基因的表达显著降低，同时神经病理性疼痛的症状也相应缓解。这些研究结果提示，GCH1基因与神经病理性疼痛有密切的关系，但GCH1基因甲基化水平与带状疱疹神经痛的发生发展是否相关，目前国内外未见相关报道。

值得注意的是，研究带状疱疹神经痛的理想标本应该是神经组织如脑、脊髓、背根神经节和皮损部位，但这些标本不易获取。研究表明，在很多疾病的发生发展过程中，其血液相关基因可以发生明显的甲基化变化，如，外周血特定基因甲基化可作为乳腺癌风险评估中组织样品的替代标志物[19]；对帕金森病患者血液的53个基因标记的DNA甲基化数据整合分析，可鉴定出帕金森病血液潜在的生物标志物[20]。目前，血液Septin9 基因甲基化状态作为结直肠癌风险评估指标，已广泛用于非侵入性结直肠癌患者筛查[21]。

基于上述分析，本研究中，我们检测了带状疱疹神经痛患者药物治疗前后及健康体检者临床血液样本全基因组及GCH1基因甲基化，初步探讨其与带状疱疹神经痛的关系。结果显示，治疗前带状疱疹神经痛患者组全基因组及GCH1 基因甲基化水平显著低于健康对照组及治疗后组，这与以往神经病理性疼痛模型[17]中GCH1 基因表达增加的结果相一致。然而，除了本研究中检测的GCH1基因甲基化外，与该种疼痛症状发生密切相关的其他基因甲基化仍需要深入研究。

DNA 甲基化相对稳定，但越来越多的研究显示，DNA 甲基化作为某些疾病表观遗传标志物是动态变化的，既可以是即时的，也可稳定存在并遗传给后代。如一夜睡眠剥夺可诱导年轻健康男性血清硬脂酰辅酶A去饱和酶的DNA 甲基化和血清活性指数发生改变[22]；帕金森病患者血液全基因组部分CPG 位点的甲基化会随着疾病的发展而动态变化[23]。而有些疾病相关基因甲基化的改变则可能需要很长时间，如孕鼠铬限制膳食可改变成年雄性后代胰岛素信号相关肝脏基因的甲基化状态[24]；新近研究还发现[25]，某些特定基因甲基化表达谱还能发生明显的隔代遗传趋势。本研究结果也显示，带状疱疹神经痛患者全基因组及GCH1 基因甲基化水平短时间内即可发生变化。但本研究仍有不足之处，如未检测疼痛与甲基化水平的关系；分组时未加设带状疱疹无神经痛组，且目前尚无证据表明所用治疗药物对甲基化水平有无影响等。

综上所述，本研究从表观遗传的角度切入，初步探讨全基因组及GCH1 基因甲基化与带状疱疹神经痛的相关性，寻求带状疱疹神经痛发生发展可能的新机制。该研究将有助于深入探讨表观遗传调控与带状疱疹神经痛的相互关系，寻找与疼痛发生发展及药物治疗效果密切相关的甲基化修饰，从而寻找甲基化调控相关的特定酶类，并将其作为带状疱疹神经痛治疗药物研发的分子靶点，为新型镇痛药物的研发提供理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突