外周血T淋巴细胞亚群变化量在寻常型银屑病中的相对危险性研究

李 迎,宋 宇,张天琦,王璐璐,黄晓迪，宋玉国*

(1.北华大学附属医院,吉林 吉林132011；2.北华大学医学院；3.吉林市中心医院；4.北华大学医学技术学院)

银屑病(psoriasis)是一种由免疫介导的、慢性全身性疾病,世界范围内其发病率为0.9%-8.5%[1,2]。根据临床特征,银屑病可分为寻常型、关节病型、脓疱型和红皮病型,其中寻常型银屑病占99%以上。临床表现以红色丘疹或斑丘疹开始,逐渐发展为持续性炎症和表皮增生,通常发生于头皮、肘部、膝盖、脐部和腰部[3,4]。病理学检测发现皮损处有淋巴细胞、单核细胞浸润,尤其以T淋巴细胞和树突状细胞在表皮或真皮浸润。一些研究进一步证实T辅助细胞(Th)17和Th1细胞介导的慢性炎症是银屑病的关键[5,6]。还有文献报道,CD3+CD4-CD-T细胞在银屑病致病机制中发挥重要作用[7]。因此,本文对寻常型银屑病患者进行了外周血淋巴细胞亚群检测,旨在为临床评价患者细胞免疫功能提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

银屑病患者34例均来自北华大学附属医院皮肤科,其中男20例,女14例,年龄(39.77±17.46)岁,全部病例符合银屑病诊断标准,且均为初诊的寻常型银屑病患者,未用免疫抑制剂及糖皮质激素等药物治疗,无病原微生物感染等其它病史。健康对照组30例均来自北华大学附属医院健康体检中心,其中男17例,女13例,年龄(36.47±9.89)岁,近期均无病原微生物感染、过敏和皮肤病等相关病史。两组在性别和年龄方面均具有可比性。

1.2 标本采集

清晨空腹采集静脉血2 ml,EDTA-K2抗凝,立即送检。

1.3 主要仪器和试剂

流式细胞仪,美国Beckman Coulter Epics XL型,用于检测T淋巴细胞亚群和NK细胞；血球计数仪,用于检测外周血淋巴细胞百分率和绝对值。荧光抗体：CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE,CD3-FITC/CD(16+56)-PE,美国Beckman Coulter公司。

1.4 淋巴细胞亚群检测

采用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群和自然杀伤(NK)细胞。在T淋巴细胞亚群检测试管中加入三种荧光抗体CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE各20 μl,在NK细胞检测试管中加入CD3-FITC/CD(16+56)-PE双色荧光抗体,分别加入被测抗凝血100 μl,混合均匀,室温避光标记15 min。加入溶血剂A600 μl,震荡7秒,再加入溶血剂B260 μl,混匀。溶解红细胞后,1 000 rpm 离心5 min,弃上清,加入PBS缓冲液4 ml,重新混匀,1 000 rpm 离心5 min,弃去上清。加入PBS缓冲液500 μl,混匀,应用流式细胞仪进行检测。此方法检测结果为T淋巴细胞总数(CD3+T细胞)、辅助性T淋巴细胞(CD4+T细胞)、细胞毒性T淋巴细胞(CD8+T细胞)和自然杀伤细胞(NK细胞)的百分率。此百分率乘以淋巴细胞绝对值即可计算出各淋巴细胞亚群的绝对值(cells/μl)。CD3+T细胞数减去CD4+T细胞数再减去CD8+T细胞数即为CD3+ CD4-CD8-T细胞数(包括百分率和绝对值)。

1.5 淋巴细胞绝对值检测

应用血球计数仪进行检测,单位是cells/μl。

1.6 统计学方法

应用spss19.0软件对所得结果进行分析,各组间的比较采用两样本t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。同时进行Logistic回归分析(Logistic regression analysis)。我们用t检验比较银屑病患者和对照组之间的年龄差异,用χ2检验比较银屑病患者和对照组之间的性别差异。采用Logistic回归模型分析各亚群细胞数量和百分率,估计银屑病发生率与对照组的优势比。为了解释Logistic回归分析的结果,我们计算了OR-1,并以%表示。由于自变量是连续的,如果自变量增加大约1个单位(1个细胞/μl或1个百分点),我们得到了银屑病风险的平均百分比变化。

2 结果

2.1 研究组特点

银屑病患者34例,正常对照组30例,两组的年龄(t=1.0057,P=0.3497)和性别(χ2=0.0304,P=0.8616),差异均无统计学意义。

2.2 银屑病患者组和正常对照组T淋巴细胞亚群数量比较

银屑病患者组34例和正常对照组30例全部检测了T淋巴细胞亚群和NK细胞百分率,T淋巴细胞亚群包括CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞。通过计算得到了以上各细胞亚群的绝对值(cells/μl)、CD3+ CD4- CD8-细胞的百分率和绝对值以及CD4/CD8比值。对两组数据进行了统计学的t检验分析(见表1)。结果显示,与对照组比较,CD3+T细胞的百分率和绝对值明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)；CD4+T细胞的百分率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而CD4+T细胞的绝对值明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)； CD8+T细胞的百分率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),但其细胞绝对值高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；CD3+ CD4- CD8-细胞的百分率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),其细胞绝对值明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)；CD4/CD8比值略高于对照组,差异无统计学意义(P>0.05)；两组比较,NK细胞的百分率和绝对值均无明显差异(P>0.05)。

表1 银屑病患者与正常对照组细胞亚群统计分析(t检验和Logistic回归分析)

3 讨论

银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性皮肤病,临床表现为鳞屑性红斑或斑块,局限分布或全身广泛分布。病理学检查证实,银屑病皮损处淋巴细胞和单核细胞浸润明显,其中浸润的淋巴细胞以T细胞为主。近期的研究表明,血液内和/或皮肤中的T淋巴细胞异常活化或免疫调节抑制作用受阻,导致皮肤发生炎症反应和角质形成细胞过度增生[8],表现为红色丘疹或斑丘疹样皮损,逐渐扩展为红色斑块,上面覆盖厚层银白色鳞屑。

因为银屑病的发病机制与T淋巴细胞的变化密切相关,所以本文研究了银屑病患者外周血中T淋巴细胞亚群的变化情况。其中淋巴细胞亚群包括辅助性T淋巴细胞(CD4+T细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)、CD3+CD4-CD8-T细胞,同时将自然杀伤细胞亦作为常见淋巴细胞亚群也进行了分析。T淋巴细胞亚群的变化情况,本文将银屑病患者与正常对照组进行对比研究,包括各淋巴细胞亚群的百分率(%)变化及在外周血中绝对值的变化(cell/ul)。在数据分析方面,本文应用t检验分析了两组数据的差异性,采用Logistic回归分析模型,统计分析了银屑病发生率与对照组的优势比,使用独立变量(百分率为第一模型,绝对数为第二模型)进行分析。为了便于解释Logistic回归分析结果,我们计算了OR-1,并以百分数(%)表示。以百分率变化和绝对值变化为自变量,由于自变量是连续的,如果自变量增大约1个单位(第一种模型中1个百分点,第二种模型为1cell/ul),我们得到了银屑病发病风险性的百分比变化,包括正相关或负相关。

我们发现,与正常对照组比较银屑病组T淋巴细胞亚群中,CD3+T淋巴细胞的百分率和绝对值均明显升高(P<0.01)；CD4+、CD3+CD4-CD8-T细胞的百分率高于对照组(P<0.05),但其绝对值明显高于正常对照组(P<0.01)；CD8+T细胞的百分率无显著差异,其绝对值高于正常对照组(P<0.05)。为了更确切地比较哪个T细胞亚群是银屑病致病的危险因素,通过Logistic回归分析,我们发现CD3+、CD4+、CD3+CD4-CD8-T细胞百分率以及CD4/CD8的比值与银屑病的发病风险呈正相关,其指标每增加1个单位,银屑病的患病患病风险分别增加22.9%、12.2%、31.9%和116.7%。

T细胞的主要作用是介导细胞免疫,调节机体免疫功能。CD3+T细胞代表T淋巴细胞总数,依其主要细胞表面分化的抗原不同,进一步分为CD4+T细胞(辅助性T细胞)和CD8+T细胞(细胞表性T细胞)两个亚群。CD4+T细胞又分为Th1、Th2和Th17三个亚群,分别作用于M4、B细胞和炎症细胞,参与细胞免疫、体液免疫和炎症反应。其中Th17细胞亚群通过分泌IL-17、IL-6、TNF-α等细胞因子参与调控炎症反应和自身免疫,也是银屑病的主要发病机制之一。通过细胞信号传导通路研究发现[9],Notch1信号通过调控Th17细胞的分化和功能,在银屑病的发病过程中发挥重要作用；采取一定措施阻断Notch1信号通路,可以减轻Th17细胞在银屑病中的致炎作用。外周血T细胞,包括CD4+和CD8+T细胞在免疫原持续刺激后参与银屑病的发生[10]。已有研究发现,在银屑病的皮损中CD4+T细胞主要积聚在真皮中,而CD8+T细胞主要积聚在表皮中,CD4+T细胞在皮肤炎症发生及角质形成细胞过度增生中发挥主导作用。本文的研究结果与上述文献报道基本一致,发现在本文入选的银屑病患者外周血中,CD4+T细胞和CD8+T细胞明显高于正常对照组,其中CD3+T细胞的增多可能是由于CD4+T细胞的增多而导致的。通过Logistic回归分析表明CD3+细胞和CD4+T细胞是银屑病的危险致病因素。在本文的研究中,也发现银屑病患者外周血中CD3+CD4-CD8-T细胞亦明显高于正常对照组,表明了这类细胞是银屑病危险致病因素。CD3+CD4-CD8-T细胞是表达γδTCR的CD3+T细胞,Cai Y[11]等报道,银屑病患者表达γδTCR的CD3+T细胞明显高于正常对照组,本文与该报道相似。

总之,银屑病病变是由不同类型细胞之间相互作用以及包括IL-17、TNF-α、IL-6和IL-23在内的多种细胞因子引起的,需要在T淋巴细胞活化、调节以及IL-23/ IL-17调节轴等方面进行深入研究,才能为银屑病的诊断和治疗提供免疫学数据支撑。