阿片受体OPRK1基因甲基化与阿尔茨海默症易感性的关系

孔祥怡，杜建时，丛乐乐，赵 晴

(吉林大学中日联谊医院 1.血管外科；2.皮肤科；3.南湖院区神经内科，吉林 长春130033)

阿尔茨海默病(AD)是痴呆综合征最常见的一种，老年人多发，其特征在于不可逆的记忆丧失和认知能力下降[1]，临床表现为进行性记忆障碍、视空间技能损害、执行功能障碍、人格和行为改变等，是60%-70%的老年痴呆症的潜在原因[2]。阿尔茨海默病的发病机制非常复杂，可能与遗传、环境密切相关[3]，而基因的甲基化作为作为其发病机制的一个部分，在阿尔茨海默病的起病过程中起着不可忽视的作用[4,5]。OPRK1作为阿片类受体基因，在人类的记忆、学习过程发挥重要作用，该基因的甲基化依靠调控基因表达促使阿尔茨海默病发病。本实验通过探讨外周血中OPRK1基因启动子区甲基化与AD发病风险的相关性，为阿尔茨海默病患者的早期诊断及治疗提供指导意见。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1研究对象 所有病例均取自2015年10月-2017年12月吉林大学中日联谊医院认知功能障碍门诊及神经内一科病房收入院的患者，AD组为老年阿尔茨海默病患者，同时选取我科门诊就诊患者既往无重大疾病，目前无急症的非AD患者为对照组。研究对象共例AD组45例，对照组55例。此项目已在我院伦理委员会批准立项，入组患者对项目知情并签署知情同意书，两组间基线资料对比无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：全部患者符合美国精神病学会的精神障碍诊断和统计手册第4修订版(DSM-IV)中AD的诊断标准；排除标准：(1)合并其他类型痴呆的患者，(2)患有严重原发性疾病患者，(3)有精神病史患者，有脑卒中、头外伤患者。

1.1.2标本收集 EDTA管留取患者清晨空腹血样，3 000 g×10 min离心，小心吸取中间白细胞层，编号，-80℃保存样本。

1.2 方法

应用Wizard Genomic DNA Purification Kit试剂盒，严格按照说明书进行DNA的提取。采用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit试剂盒，(购于德国Qiagen公司)，严格按照试剂盒说明书进行DNA的亚硫酸氢盐处理。以亚硫酸氢盐处理后的DNA模板为样本，利用甲基化及非甲基化引物通过PCR扩增仪进行扩增。总反应体系25 μl，DNA模板1 μl，EpiTect Master Mix12.5 μl，RNase-free water 10.5 μl，甲基化及非甲基化引物各0.5 μl。PCR反应条件为95℃预变性10 min，94℃变性15 s，55℃退火30 s，共40个循环，最后72℃延伸10 min，4℃

保存，取5 μl PCR产物、1 μl Loading Buffer，通过绿如蓝核酸染料进行染色，在3.0%琼脂糖凝胶中上样，120V电泳，在全自动凝胶成像系统GelDocXR+下显像。OPRK1基因以甲基化引物(M)出现产物条带判断为阳性，非甲基化引物(U)出现产物条带判断为阴性，当甲基化引物出现产物条和非甲基化引物同时出现产物条带判断为阳性。

1.3 统计学分析

采用SPSS20.0统计软件处理对计量资料进行方差齐性检验，相关性分析采用χ2检验。

2 结果

2.1 OPRK1基因甲基化结果

AD组OPRK1基因启动子区甲基化率明显高于对照组，经统计学分析，两者比较，χ2值=22.37，P<0.05，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 OPRK1基因甲基化结果

注：χ2=22.37；P<0.05.

2.2 MSP扩增产物凝胶电泳图

图1.1示：AD组U出现产物条带，部分M出现产物条带；图1.2为对照组，M及U均出现产物条带，既存在甲基化改变，又存在非甲基化改变。

注：Marker:2000 bp DNA； U:unmethylation ； M:methylation

3 讨论

脱氧核糖核酸甲基化是基因调控常见的表观遗传学之一，脱氧核糖核酸甲基化是将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的一种反应[6]。表观遗传修饰包含脱氧核糖核酸甲基化、组蛋白修饰和微小核糖核酸。甲基化能够影响脱氧核糖核酸与蛋白质相互作用方式，进而改变基因的表达形式[7,8]，不同基因的甲基化可能从多方面影响痴呆的发生。

OPRK1基因编码阿片受体，基因发生甲基化与阿尔茨海默病的发病可能有一定的关系，被认为是治疗神经疾病的药物靶点，在认知障碍的发生过程中起着关键作用[9]。阿片受体主要分布在海马区域[10]，它利用神经保护作用，减少β-淀粉样蛋白的生成，影响阿尔茨海默病的发病[11,12]。随着老龄化社会的到来，阿尔茨海默病的人群患病率逐年上升，阿尔茨海默病的发病机制至今仍很不明确，早期的诊断尤为困难，给患者本人、家庭、社会带来了沉重的负担，所以对阿尔茨海默病发病机制探索，从分子生物学水平有大量的研究证明，阿尔茨海默病的发病与脱氧核糖核酸甲基化密切相关[13]。

脱氧核糖核酸的甲基化可能造成神经退行性疾病发生，本次研究中，阿尔茨海默病组的基因甲基化率明显高于健康对照组，OPRK1基因启动子区发生甲基化改变阿尔茨海默病组的患者检测出共有31(68.89%)例患者，而在健康对照组中只有12(21.82%)例患者发生改变，JiHuihui等人也作出了同样的结果[14]。性别是阿尔茨海默病发病风险的一个重要因素，有研究表明基因组甲基化在男、女之间有一定的区别[15]，本次研究显示阿尔茨海默病OPRK1基因甲基化与男女性别无相关性，这个结果可能需要更多的实验研究阐明性别对表观遗传变化的影响，基于分子、细胞和小鼠动物模型等多个层次系统的研究都取得了丰硕的成果[16]。

目前，随着基因检测技术的不断进步，与阿尔茨海默病发病相关的易感基因的甲基化状态被逐渐被人类发现，可以在早期发现这些易感基因的改变，从而建立一个易感基因谱，为疾病的早期诊断、早期治疗提高科学的依据。