菟丝子总黄酮对卵巢早衰大鼠卵巢功能的作用研究

王永霞，马 娜，钟兴明，崔 蓉，苗竹林

(1.国家卫生健康委员会男性生殖与遗传重点实验室，广州 510600； 2.广东省计划生育科学技术研究所 生殖免疫遗传中心,广州510600；3.广东药科大学基础学院,广州 510610)

卵巢早衰是指女性40岁之前出现卵巢功能减退的现象，伴有高促性腺激素和低雌激素水平。卵巢早衰的病因非常复杂，目前研究已经明确的发病因素包括遗传性、自身免疫性、感染性、医源性、环境及心理等。80%以上的患者发病原因不明确,大多数患者得不到相应的病因诊断[1-4]。中药菟丝子是中医温补肾阳的要药，常用于治疗妇科内分泌疾病,疗效确切[5-7]。菟丝子是一种旋花科植物菟丝子或大菟丝子的成熟种子，主要生物活性成分为菟丝子总黄酮(total flavonoids from semen cuscutae,TFSC)。多项药理研究发现，菟丝子及TFSC在改善人体的生殖内分泌功能、抗氧化、增强免疫力、保护心血管和抗突变等方面都有较好的作用，在改善和提高人体生殖内分泌系统功能方面的作用更加显著[8-11]。王晓红[12]研究发现，以菟丝子为主的抗衰复巢汤联合激素补充疗法能有效治疗卵巢早衰，提高患者的生殖激素水平。但单独应用TFSC对卵巢早衰的作用研究较少。本实验通过建立成熟的大鼠卵巢早衰模型，观察TFSC对卵巢早衰大鼠卵巢功能的作用，为TFSC在临床的进一步应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂TFSC的提取与分离技术 取菟丝子药材粉碎过筛后经石油醚脱脂，加75%乙醇6倍量，加热回流提取2次，每次2 h。滤过，合并滤液，减压回收75%乙醇，加水稀释至0.1 g生药/mL，置已经处理好的D101大孔树脂柱中，以水洗至流出液近无色，弃去，再以梯度乙醇、水从低浓度至高浓度梯度洗脱，收集35%～65%浓度的洗脱液，减压回收乙醇合并浓缩成稠膏状，减压干燥，粉碎，过筛即得总黄酮。

1.2 实验动物与造模 200～250 g雌性健康SD大鼠由广东省医学实验动物中心提供，适应性喂养2～3 d，连续5～10 d做阴道涂片，有动情周期的大鼠纳入实验。90只大鼠依据随机数字法分为正常组、模型组、雌激素对照组以及TFSC低、中、高剂量(35、70、140 mg/kg)组，每组15只，除正常组不造模外，其余均造模，采用一次性的腹腔注射环磷酰胺(120 mg/kg)联合皮内注射白消安(12 mg/kg)制造大鼠卵巢早衰模型[13]。注射结束后，每天上午9：00～10：00取大鼠阴道脱落细胞，置于显微镜下观察动情周期变化，若出现动情周期紊乱、动情间期延长、动情期消失等现象即为造模成功[14]。

1.3 动物实验 所有大鼠造模成功后同时给药，按照TFSC低、中、高剂量组(35、70、140 mg/kg)灌胃，正常组和模型组均给予同体积的0.9%NaCl注射液。雌激素对照组给予雌二醇溶液(0.3 mg/kg)灌胃。灌胃给药10 d后处死所有大鼠，称重，剖腹取出卵巢，取血清于-20 ℃冰箱保存。

1.4 观察指标

1.4.1 动情周期的观察 采用阴道脱落细胞涂片观察大鼠的动情周期，用消毒棉签插入大鼠阴道约0.5 cm，轻轻转动2～3圈，均匀涂在洁净的载玻片上，巴氏染色后，显微镜下观察。观察标准如下。①动情前期：绝大多数细胞为椭圆形的有核上皮细胞。②动情期：镜下绝大多数细胞为片状无核角化细胞。③动情后期：镜下主要为白细胞、有核上皮细胞、片状角化细胞。④动情间期：镜下绝大多数细胞为白细胞[15]。

1.4.2 性激素水平 取大鼠血清采用化学发光法进行雌二醇、卵泡刺激素测定。

1.4.3 卵巢指数 取出卵巢后，采用电子天平称重并计算卵巢指数[16]。卵巢指数=卵巢湿重(mg)/体重(g)×100%。

1.4.4 病理形态学观察和卵泡计数 ①取大鼠卵巢，用10%甲醛溶液浸泡固定后进行组织脱水、透明、浸蜡、包埋后制成蜡块保存；②将组织块切成 3～4 μm石蜡切片，进行常规苏木精-伊红染色法染色，显微镜下观察卵巢的形态学变化；观察卵泡发育，计数卵泡数量。

2 结 果

2.1 TFSC对卵巢早衰大鼠动情周期的影响 除正常组，模型组、雌激素对照组及TFSC低、中、高剂量组大鼠的动情周期均发生紊乱，其中模型组表现为持续延长的动情间期、无动情前期或动情期。正常组、雌激素对照组及TFSC低、中、高剂量组的动情期分别为4～5 d、5～6 d、7～8 d、6～7 d、5～6 d。

2.2 TFSC对卵巢早衰大鼠性激素水平的影响 各组大鼠的雌激素水平均不同程度的降低，其中模型组、TFSC低剂量组低于正常组(P<0.05)，雌激素对照组及TFSC中、高剂量组雌二醇水平高于模型组(P<0.05)；各组大鼠卵泡刺激素水平均有不同程度的降低，其中，模型组、雌激素对照组及TFSC低、中、高剂量组卵泡刺激素水平低于正常组，TFSC低剂量组低于模型组(P<0.05)。见表1。

2.3 TFSC对卵巢早衰大鼠卵巢指数的影响 各组大鼠体重、卵巢指数比较差异有统计学意义(P<0.05)，与正常组比较，模型组及雌激素对照组及TFSC低、中、高剂量组的体重、卵巢指数均降低(P<0.05)，但与模型组比较,TFSC高剂量组大鼠体重、卵巢指数均升高(P<0.05)，与雌激素对照组比较，TFSC低剂量组体重升高(P<0.05)。见表2。

组别只数雌二醇(pg/mL)卵泡刺激素(mU/mL)正常组1595.21±21.120.036±0.003模型组1554.87±25.05a0.026±0.002a雌激素对照组1578.87±30.04b0.025±0.003aTFSC低剂量组1565.61±27.61ab0.023±0.001abTFSC中剂量组1569.83±23.93b0.026±0.002aTFSC高剂量组1579.92±26.11b0.027±0.003aF值4.33951.420P值0.002<0.001

TFSC：菟丝子总黄酮；a与正常组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05

组别只数体重(g)卵巢指数(×10-1)正常组15263.65±5.183.88±0.17模型组15232.23±4.15a2.87±0.13a雌激素对照组15257.12±3.37a3.15±0.19aTFSC低剂量组15255.22±4.02ac3.24±0.21aTFSC中剂量组15256.61±3.78a3.36±0.18aTFSC高剂量组15258.11±3.69ab3.54±0.15abF值108.57056.451P值<0.001<0.001

TFSC：菟丝子总黄酮；a与正常组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05；c与雌激素对照组比较，P<0.05

2.4 各组大鼠的卵巢组织形态学及卵巢中卵泡计数比较 显微镜下观察，正常组(图1a)卵巢体积大，卵泡生长活跃，可见各级卵泡分布，颗粒细胞层次多；黄体发育好，黄体细胞丰富。模型组(图1b)卵巢萎缩明显，卵泡数量减少，闭锁卵泡数量增多，卵泡颗粒细胞层减少，黄体数量减少。雌激素对照组(图1c)及TFSC低、中、高剂量组(图1d～f)卵巢体积较模型组大，卵巢皮质内可见大量初级卵泡及生长卵泡，较多接近成熟卵泡，颗粒细胞层次多，黄体发育细胞较多。以用药高剂量组最为明显。各组大鼠总卵泡数、生长卵泡、闭锁卵泡/总卵泡比较差异均有统计学意义(P<0.05)，模型组、雌激素对照组及TFSC低、中、高剂量组总卵泡数少于正常组，雌激素对照组及TFSC中、高剂量组多于模型组(P<0.05)；模型组、雌激素对照组及TFSC低、中剂量组生长卵泡少于正常组，雌激素对照组及TFSC中、高剂量组多于模型组(P<0.05)；雌激素对照组及TFSC低、中、高剂量组闭锁卵泡/总卵泡低于模型组(P<0.05)。见表3。

a：正常组； b：模型组； c：雌激素对照组； d：TFSC低剂量组；e：TFSC中剂量组； f：TFSC高剂量组；→：生长卵泡；▲：黄体；△：闭锁卵泡；TFSC：菟丝子总黄酮

图1 各实验组大鼠卵巢组织形态图(苏木素-伊红染色，×100)

3 讨 论

对病因不同的卵巢早衰患者,临床普遍使用激素替代疗法进行治疗，而卵巢早衰患者大多伴有生育问题，对有生育要求的患者，如何改善提高卵巢功能已成为一个迫切需要解决的问题。近年来，中医药对卵巢早衰的治疗也取得很大进展，中医在辨证治疗上从肝肾入手,兼及气血、痰湿等,促进性腺轴正常功能的恢复,提高卵巢功能,防止卵巢组织出现病理性改变,使性激素达到平衡[17]。张立[18]应用补肾剂治疗36例卵巢早衰患者,结果显示患者的雌激素缺乏症状明显减轻,有的甚至消失,生殖器萎缩得到有效改善,其中1例妊娠。进一步说明采用中医药治疗能从根本上恢复脏腑、冲任的功能,从而使机体达到阴阳平衡，脏腑和谐,气血旺盛，进一步恢复性腺轴功能,使卵巢功能早衰现象得到改善。

组别只数总卵泡数(个)生长卵泡(个)闭锁卵泡/总卵泡正常组1529.15±3.5122.89±4.190.21±0.07模型组1512.34±3.78a7.68±3.56a0.39±0.06雌激素对照组1525.88±3.23ab18.76±3.15ab0.25±0.09bTFSC低剂量组1518.92±3.19a13.69±4.10a0.30±0.03bTFSC中剂量组1522.97±3.54ab15.92±3.79ab0.28±0.09bTFSC高剂量组1524.74±3.49ab17.81±3.46b0.24±0.04bF值44.23428.70513.158P值<0.001<0.001 <0.001

TFSC：菟丝子总黄酮；a与正常组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05

中药菟丝子是常用的补肾中药，在临床上用单味中药菟丝子治疗性腺功能障碍也取得显著疗效[19-20]。研究发现菟丝子对下丘脑-垂体-性腺轴功能有多方面的作用：促进下丘脑-垂体促性腺功能的恢复,提高垂体及卵巢对激素的反应性，促进卵泡的发育，增强卵巢激素受体的数目与功能，具有类雌激素样活性[21-22]。说明菟丝子能明显改善生殖系统功能，尤其是提高卵巢功能。

本研究结果显示，TFSC对卵巢早衰的大鼠动情周期有明显的恢复作用，尤其是TFSC高剂量组大鼠动情周期与雌激素组基本无差别，说明TFSC有类雌激素样的作用。血清学激素检测也说明这一点，用药组卵巢早衰大鼠体内雌激素水平和卵泡刺激素的水平均有明显提高，这与其他研究结果[23]一致，说明TFSC能明显恢复卵巢早衰大鼠的卵巢内分泌功能。TFSC低、中、高剂量组大鼠的体重和卵巢指数虽与正常组比较略有降低，但也明显高于模型对照组，进一步说明TFSC能一定程度低恢复卵巢功能，且TFSC高剂量组疗效最显著。这也与临床应用中药菟丝子治疗卵巢早衰取得疗效的结果一致。

同时，通过对各实验组大鼠卵巢组织的病理形态学观察及卵泡计数结果也印证了这一结果。本研究结果显示，模型组大鼠的卵巢明显萎缩，卵泡数量减少，闭锁卵泡增多，而雌激素对照组及TFSC低、中、高剂量组卵巢体积较模型组大，卵巢皮质内可见大量初级卵泡及生长卵泡，较多接近成熟卵泡，以TFSC高剂量组最为明显。表明TFSC能明显促进卵巢早衰大鼠卵巢的各级卵泡发育，尤其是促使优势卵泡成熟化及颗粒细胞增殖，增加雌激素分泌，具有类雌激素样的作用，对大鼠卵巢早衰有明显的治疗效果。

综上所述，TFSC对大鼠卵巢早衰有明显的疗效，可以明显提高大鼠血清雌激素水平，恢复卵巢早衰大鼠的动情周期，促进卵巢内卵泡发育及颗粒细胞增殖。为进一步开发和研究补肾中药菟丝子在临床治疗卵巢早衰提供了一定的研究基础。