糖尿病对心肌低氧诱导因子-1的影响及研究进展

侯天亮，杨 龙，郑 宏

(新疆医科大学第一附属医院麻醉科，乌鲁木齐 830054)

众所周知，处理心肌梗死最有效的方法是缩短心肌缺血时间，尽早恢复血液灌注，但血液供应的快速恢复也会对组织造成更大的伤害，这一矛盾现象称为心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤[1]。心血管手术患者在围术期难免会发生不同程度的I/R损伤,尤其合并糖尿病时，患者术后心脏的相关并发症和死亡率都将明显增加[2]。国际糖尿病联盟发布的第8版糖尿病地图显示,目前全球糖尿病患病人数已达4.51亿，预计到2045年，这个数字将增加到6.93亿，并呈逐年增长的趋势[3]。因此，如何防治糖尿病患者围术期I/R损伤将是未来亟待解决的难题。

研究显示，低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor，HIF-1)在机体抵抗I/R损伤中发挥重要作用，其下游的靶基因在心肌组织缺血缺氧的情况下被大量激活，通过调控心肌细胞线粒体自噬、血管形成、活性氧平衡等途径发挥心肌保护作用[4]。然而，患有糖尿病时，HIF-1介导的心肌保护作用却大大减低[5]。现就糖尿病对心肌HIF-1的影响及研究进展予以综述。

1 HIF-1概述

1.1 HIF-1的结构与代谢 HIF-1是低氧诱导因子家族(hypoxia inducible factors,HIFs)成员之一，由组成性表达的HIF-1β亚基和受氧浓度调节的HIF-1α亚基组成。在常氧条件下，HIF-1经脯氨酸羟化酶(prolyl-4-hydroxylase domain-containing enzymes,PHD)羟化、E3泛素连接酶连接，最终被蛋白酶体识别和降解[6]。有研究表明，HIF通路与泛素系统的相互作用不是一条单向通路，HIF通路的成分与泛素系统存在相互调节[6]。在缺氧条件下，PHD的活性受到抑制，HIF-1的泛素化和降解减少，细胞核中HIF-1α 与HIF-1β形成异源二聚体，在CREB-结合蛋白/p300等转录激活因子的存在下，结合到靶基因启动子的低氧反应元件上，调控下游一系列靶基因的转录，从而有利于细胞在低氧条件下生存[7]。

1.2 HIF-1是介导心肌对抗I/R损伤的核心靶点 心肌缺血预处理(ischemia preconditionin,IPC)是指心肌在长时间缺血之前经历几次短暂的I/R损伤的过程。IPC可有效减轻I/R损伤，这是迄今为止发现的最有效的心肌保护策略[8]。IPC的这种心肌保护作用很大程度上是通过激活HIF-1下游靶基因发挥作用的[9]，当HIF遗传缺失时，IPC的心肌保护作用也会减弱[10]。但出于伦理学考虑，IPC的临床应用受到很大程度的限制。近年来动物研究表明，七氟醚后处理可通过上调心肌细胞HIF-1的水平，产生类似IPC的心肌保护作用，并可避免IPC的伦理学问题，是一种非常有潜力的心肌保护策略[11]。

2 糖尿病对心肌HIF-1的影响

2.1 HIF-1信号转导 糖尿病是一种影响葡糖糖稳态的疾病，影响机体不同的器官和系统，导致严重并发症，如心血管疾病、糖尿病肾病、神经病变、视网膜病变以及影响伤口愈合等。组织暴露于高血糖环境被认为是影响并发症发生的主要因素，但即使严格控制血糖也不能完全预防并发症的发生[12]。在高糖环境下，通过多元醇途径代谢的葡糖糖增加，最终使烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原态/氧化态的比值增大，机体出现“假性缺氧”现象。在一项基础研究中，试验者使用哌莫硝唑(缺氧组织标志物)检测机体的缺氧水平发现，糖尿病组织中哌莫硝唑的水平明显高于非糖尿病组织[13]。在蛋白质水平上，除缺氧刺激可稳定HIF-1α的表达，有氧糖酵解的产物(主要是丙酮酸盐)也可以稳定其表达。相反，高糖通过修饰协同激活因子p300影响HIF-1的转录，从而在不影响HIF-1α蛋白稳定性的情况下，降低HIF-1的转录活性[12]；高糖还通过碳水化合物反应元件结合蛋白激活HIF-1介导的信号转导[14]；此外，高糖诱导的信号转导失调还包括HIF-1对低氧状态的反应，在高血糖环境下培养的细胞面对缺氧刺激，HIF-1不但没有被及时激活反而降解增加[15]。因此，糖尿病不仅会导致缺氧，还会影响HIF-1信号转导。如果细胞/组织不能对缺氧做出及时的应激反应，那么糖尿病患者并发症的发生率会大大增加。

2.2 血管生成因子 当组织灌注不足时，低氧会激活HIF-1，进而产生大量调控血管生成的因子，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质细胞衍生因子-1、血管生成素等，导致骨髓源性血管生成细胞动员，增加血管生成和动脉重塑[16]，这对于心肌缺血/缺氧诱导的血管生成的调节和损伤心肌组织的恢复至关重要。在糖尿病环境中，由于细胞对缺氧反应迟钝,大部分HIF-1α靶基因降低,糖尿病患者心室中VEGF和VEGF受体2含量降低[17]。同样，在糖尿病大鼠中，VEGF-A及其受体VEGF受体1和VEGF受体2在基因和蛋白水平的表达也降低，当心肌发生缺血/缺氧损伤时，HIF-1/VEGF通路介导的血管生成及修复受损血管的作用减弱，新生的毛细血管数量减少，有效侧支循环血管形成障碍[18]，心肌受损；糖尿病患者肢体末端伤口愈合障碍和血液循环不良也是由于HIF-1/VEGF途径受损，肢体末端血管密度下降所致[19]；VEGF的表达水平在肾小球中明显下调，并导致足细胞死亡，是血栓性微血管病变和糖尿病肾病的重要环节[20]。此外，HIF-1下游的其他靶分子也能促进血管生成，如内皮型一氧化氮合酶、基质细胞衍生因子-1等，这些分子在糖尿病心肌中同样低表达，与VEGF的调控紊乱共同导致糖尿病心肌I/R时侧支循环血管生成障碍。

2.3 心肌能量代谢 HIF-1对低氧诱导的糖酵解关键酶有调控作用，通过激活丙酮酸脱氢酶激酶1使心肌能量代谢从氧化磷酸化转变为糖酵解，还可增加丙酮酸激酶、磷酸果糖激酶等糖酵解关键酶的水平。心肌缺血/缺氧时，通过糖酵解途径产生维持细胞存活的基本能量有利于为能量需求量很大的心肌组织供能。糖尿病患者由于胰岛素缺乏或敏感性降低，导致机体利用葡糖糖的能力受限，使机体长时间处于高血糖状态下，导致机体甲基乙二醛的产生和积累增加[21]。研究证实，甲基乙二醛通过诱导缺氧条件下HIF-1的降解而损害细胞适应低氧张力的能力[15]。由于HIF-1的降解，丙酮酸脱氢酶激酶1等一系列HIF-1下游能量代谢的关键靶基因表达降低，心肌不能从无氧酵解途径获取足够的能量，进而加快了心肌细胞凋亡；同时在糖尿病环境下由于HIF-1下调，损害了葡糖糖转运体4向骨骼肌质膜的转运，影响糖吸收[22]，这就使本来糖利用障碍的心肌细胞更加缺乏维持生命的能量，从而加重心肌损伤。

2.4 活性氧类(reactive oxygen species,ROS)和炎症 ROS与HIF-1的相互作用是复杂的、双向的，生理水平的ROS具有信号转导功能，调节机体的多种生理过程,可稳定并激活HIF-1[23]。正常情况下，HIF-1主要通过以下几种途径减少ROS的产生，从而起到心肌保护的作用。①改变能量代谢方式，减少电子传递链产生ROS的量[24]。②HIF-1诱导线粒体选择性自噬，清除受损老化的线粒体，从而减少ROS的生成[24]。③HIF-1α通过诱导miR-210转录，阻断线粒体呼吸和电子传递链的活性，减少ROS的产生[24]。在糖尿病心肌中，高血糖有助于葡萄糖的自动氧化、代谢和糖基化终末产物的产生，过量ROS的产生是糖尿病的标志物。超氧化物歧化酶是一种主要的内源性抗氧化酶，高糖条件下在机体的表达显著降低[25]。当糖尿病心肌发生I/R时，过量的ROS在铁离子的作用下激活PHD，并可提高泛素蛋白酶体的活性，进而促使HIF-1α在转录后降解；NO具有介导HIF-1α积累和活化的能力，但在糖尿病环境下，由于超氧阴离子(O2-)的过度产生，并与NO反应，使稳定状态的NO的水平降低,从而失去活化HIF-1α的能力[26]。最新研究表明，过量的ROS是炎症的主要驱动因素，而炎性因子也会反过来刺激ROS的大量产生，两者相互协同，进一步加重心肌细胞损伤[27]。

2.5 线粒体自噬及凋亡相关蛋白 线粒体是真核生物细胞能量代谢的主要场所，同时也是细胞缺血/缺氧性损伤的主要目标。心肌细胞线粒体凋亡速度的加快是糖尿病心肌损伤的主要途径。Bcl-2家族具有调控心肌线粒体凋亡途径的作用，包括抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax以及p53上调的凋亡调节物(p53-upregulated modulator of apoptosis,PUMA)[28]，受HIF-1α直接转录调控的Bcl-xL蛋白、骨髓细胞白血病-1蛋白等分子是抗凋亡蛋白Bcl-2家族的重要成员[29]。当糖尿病心肌发生I/R损伤时，抗凋亡蛋白Bcl-xL、骨髓细胞白血病-1等的表达降低，线粒体的膜电位降低，并促进了细胞色素C释放，激活了胱天蛋白酶-3,还可使PUMA的表达增加，最终加快心肌细胞的凋亡[30]。Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B interacting protein 3，BNIP3)是Bc1-2家族中BH3-only亚家族的成员之一，是一种线粒体外膜蛋白，受HIF-1的调控，在低氧时能被HIF-1转录激活，使BNIP3的表达上调。BNIP3的磷酸化程度直接决定其是促进凋亡还是促进线粒体自噬，在HIF-1介导的缺氧反应通路中发挥着重要作用。BNIP3丝氨酸17和24位点的磷酸化可直接促进与抗凋亡蛋白Bcl-xL的结合，直接招募自噬相关蛋白LC3Ⅱ促进线粒体自噬流的启动[31]。然而BNIP3是否是HIF-1介导线粒体动态变化及糖尿病心肌代谢紊乱的关键低氧敏感基因尚不清楚。

3 HIF-1为靶点的糖尿病心肌保护策略

3.1 PHD抑制剂 常氧条件下，HIF-1的降解大致需要经过PHD羟化、E3泛素连接酶连接以及溶酶体识别3个步骤，在任一环节上阻止HIF-1的降解都能起到心肌保护的作用。目前，氯化钴和去铁胺是最常见的PHD抑制剂，可通过抑制PHD的羟化稳定HIF-1α。研究发现，去铁胺和氯化钴可以直接活化HIF-1，恢复七氟醚处理后对糖尿病大鼠心脏的保护作用[11,32]；此外，氯化钴减少糖尿病肾病的组织学损伤以及蛋白尿也是通过上调HIF-1α基因实现的[33]；在1型糖尿病大鼠中，间歇性低氧可以降低糖尿病大鼠心脏中PHD2和PHD3的蛋白水平，诱导心脏组织中HIF-1α和VEGF蛋白的表达，减少氧化应激，对1型糖尿病大鼠的左心室具有良好的心血管重塑作用[34]。

3.2 抗氧化剂 糖尿病心肌ROS产生增多，机体氧化应激增强，HIF-1α水平降低。理论上讲，应用抗氧化剂既可以降低机体氧化应激损伤，又能稳定HIF-1α的水平，但事实并非如此。使用维生素E和谷胱甘肽等抗氧化剂作为减轻氧化应激的治疗策略并未证明是有效的，这可能是由于维生素E等抗氧化剂不加区别靶向造成的。SBT-20是一种具有靶向线粒体保护作用的新型肽类化合物。研究表明，SBT-20能靶向定位于线粒体内膜，有效降低线粒体中的ROS，从而达到保护线粒体，进而保护细胞的目的[35]。在多种I/R疾病如心肌梗死、器官移植以及脑卒中等动物模型中，SBT-20均显示出较好的器官保护作用，因此靶向线粒体的抗氧化剂值得临床验证和推广。此外，金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一种富含半胱氨酸短肽的金属结合蛋白，其广泛存在于生物体内，对多种重金属具有高度亲和力，不但可以防止重金属对体内细胞的氧化损伤，而且MT对HIF-1还有活化作用，参与机体其他的生理和病理过程，如细胞增殖和存活等，有助于糖尿病心肌的葡萄糖利用和血管生成[36]。

3.3 生物工程技术 将无致病原性的腺相关病毒载体和目的基因HIF-1重组，并靶向转导入糖尿病心肌，能够起到上调机体HIF-1α水平，诱导下游关键靶基因表达，从而达到保护心肌的目的。Mace等[37]在2型糖尿病小鼠模型中导入HIF-1α重组腺病毒表达质粒，恢复了糖尿病心肌HIF-1α的表达水平，达到了加速组织修复的目的。局部腺病毒介导的稳定HIF-1α重组体可增加 HIF-1的活性，并使其下游调控血管内皮增殖的靶基因VEGF-A表达正常化，达到预防糖尿病并发症的目的[38]。研究证明，通过转基因手段使小鼠心脏特异性HIF-1α过表达，对糖尿病诱导的葡萄糖代谢和血管生成缺陷的心脏具有保护作用[39]。生物工程技术对于基因表达降低或信号通路受损的疾病具有独到优势，值得广大研究者深入研究。

4 小 结

功能完整的HIF-1通过与低氧反应元件结合，调控下游血管内皮生长因子、线粒体凋亡相关蛋白、糖酵解关键酶等大量靶基因发挥心肌保护作用，同时也是IPC和七氟醚后处理等诸多心肌保护策略的核心靶点。然而，在糖尿病环境下，由于HIF-1信号转导通路受损，VEGF、Bcl-2等下游靶基因表达水平降低、ROS产生过多，导致糖尿病心肌在I/R损伤时易损性增加。但目前对糖尿病心肌HIF-1表达弱化的具体机制仍然无法完全阐明，可能与机体长期高血糖状态以及机体无菌性炎症状态有关。因此，深入探讨糖尿病状态下HIF-1信号通路受损的原因以及如何通过有效手段恢复糖尿病状态下HIF-1介导的心肌保护作用将是后期研究的主要方向。