CYP2C19基因多态性与心力衰竭合并肺动脉高压的关联研究

武子举

(平顶山市第二人民医院心内一科，河南 平顶山467000)

慢性心力衰竭是临床中一种常见病，病因包括高血压性心脏病、瓣膜病和冠心病等[1-4]。而左心衰是引起肺动脉高压的常见病因[1]。相关研究显示，近2/3的心力衰竭患者可能合并肺动脉高压[2]。而心力衰竭患者一旦合并肺动脉高压，其死亡风险会显著增加[3，4]。因此，如何提高心力衰竭合并肺动脉高压患者的诊断也就显得尤为必要。CYP2C19基因编码细胞色素P450超家族酶的成员[5]。细胞色素P450蛋白是单加氧酶，其催化许多涉及药物代谢和胆固醇，类固醇和其他脂质合成的反应，这种蛋白质定位于内质[6]。之前有研究表明，CYP2C19等位基因功能缺失与不良的心血管事件明显相关[7-9]。此次研究为了探究CYP2C19基因多态性与心力衰竭合并肺动脉高压患者的相关性，我们院于2014年6月至2016年6月期间收治了50例心力衰竭合并肺动脉高压患者以及招募等数量健康人群，分析CYP2C19 rs12248560基因多态性与心力衰竭合并肺动脉高压患者的关联，结果如下：

1 材料与方法

1．1 一般资料 我院于 2014年6月至 2016年6月期间收治了50例心力衰竭合并肺动脉高压患者以及等数量健康人群的外周血样本，其中心力衰竭合并肺动脉高压病患者中有男性30例，女性20例，年龄范围为14岁至43岁，平均年龄为（37．5±5．3）岁；正常人群组男性 32 例，女性 18 例，年龄范围为 13 岁至 45 岁，平均年龄为（38．6±5．1）岁。纳入标准：1）所有患者均经心脏彩超检查，诊断为慢性心力衰竭合并肺动脉高压；2）肺动脉高压为轻、中度者；3）患者未接受钙离子拮抗剂、前列环素类药物的治疗。排除标准：其他原因引起的肺动脉高压，原发性肺动脉高压，肺动脉高压重度者，使用氯吡格雷以外的抗血小板药，抗凝血剂或奥美拉唑作为质子泵抑制剂，血小板计数为低于150000/mm3，血细胞比容值＜33%或血清肌酐值＞2．5mg/dl。该研究通过本院伦理委员会批准，且招募患者及健康志愿者均在知情同意书签字。两组患者的一般临床资料如性别、年龄、病程等无明显差异（P＞0．05），结果具有可比性。

1．2 研究方法

1．2．1 DNA提取 在所有样本中用酚/氯仿抽提核酸的方法提取外周血的DNA。

1．2．2 引物合成 CYP2C19基因上游和下游的引物合成序列见表1，引物由上海烈冰生物技术有限公司合成。

1．2．3 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增 预变性 95°C 4min、变性 95°C 30s、退火 56°C 30s， 延伸 72°C 30s，72°C 末延伸 5min；共35个循环；酶切体系及条件：10X FastDigest Gren Bufer 2μl，FastDigestenzyme 1μl(rs11615 使 用Eam1105I，rs13181 使用 AleI)，ddH2O 17μl，PCR 产物 10μl；水浴 37°C 酶切 10min，然后取出立即置水浴65°C灭活5min；使用2%琼脂糖凝胶，电泳45min，电压设置为145V。

表1 基因引物设计

1．3 统计学分析 使用padgragh 6．0统计软件进行分析。采用卡方检验分析Hardy-Weinberg遗传平衡定律和两组间基因型和等位基因频率分布的差异。检验水准α值取双侧0．05。

2 结果

2．1Hardy-Weinberg遗传平衡检验 CYP2C19 rs12248560的CC、CT、TT基因型在对照组组数目分别为 34、12、4， 符合 Hardy-Weinberg遗传平衡检验（χ2=0．12，P=0．94）。

2．2 CYP2C19 rs12248560基因型和等位基因频率在心力衰竭合并肺动脉高压患者组与健康对照组的分布 由表2结果表明，CYP2C19 rs12248560基因多态性均存在3种基因型，对各基因的3种基因型分布经卡方检验分析发现CYP2C19 rs12248560 的基因型分布有显著差异（χ2=7．15，P=0．027）。 CYP2C19 rs12248560 的 C、T 等位基因在心力衰竭合并肺动脉高压患者组的分布频率分别为65%、35%；在正常对照组的分布频率分别为76%、24%；两组间差异具有统计学意义（χ2=5．36，P=0．024）。 见表 3。

表2 CYP2C19 rs12248560基因型频率分布[n(%)]

表3 CYP2C19 rs12248560等位基因频率分布[n(%)]

2．3 CYP2C19 rs12248560多态性与心力衰竭合并肺动脉高压发生的关系 分析CYP2C19 rs12248560基因的基因型与心力衰竭合并肺动脉高压的关系时发现CYP2C19的T（突变型）等位基因与C（野生型）等位基因比较，差异具有统计学意义 （χ2=6．35，P=0．049）。见表 4。

表4 CYP2C19 rs12248560基因多态性与心力衰竭合并肺动脉高压的关系[n(%)]

2．4 PCR扩增 对CYP2C19 rs12248560位点的野生型、杂合突变型和纯合突变型三种基因型和样本进行PCR扩增，2%琼脂变性凝胶电泳结果显示，PCR扩增的DNA产物片段大小与预期相同，在91bp附近，每孔只有一条亮带，条带清洗无杂带，PCR扩增特异性好。见图1。

图1 PCR产物电泳图

3 讨论

冠心病、高血压和瓣膜病患者均可能会出现慢性心力衰竭，其中左心衰竭最为常见[10]。左心衰竭会造成肺动脉压升高，不仅能引起左室收缩功能受损，而且能引起左室舒张功能受损；而左室舒张功能受损则引起右室收缩压升高，进一步造成肺动脉压升高[11]。此外，左室舒张功能受损还会引起心室肌主动舒缓延迟，减少肺静脉流入左心房的血流量，从而加大左心房的代偿性收缩，造成逆向进入肺静脉的血流增加，进一步升高肺动脉压。心力衰竭一旦合并肺动脉高压，其死亡率会显著升高[12]。为进一步提高对心力衰竭合并肺动脉高压的诊断，对后续治疗提供可靠依据，最近利用基因组学的精准治疗的应用越来越广泛。

之前有研究表明外周血管内皮功能障碍与CYP2C19变异体患者有关联[13]。内皮功能在维持血管张力，血栓形成，血小板粘附和血管系统血细胞稳态中起重要作用，内皮功能受损反映早期动脉粥样硬化改变[14]。动脉粥样硬化改变引起慢性炎症[15]，包括将血小板募集到内皮损伤部位，导致血小板活性的激活，最近报道内皮功能障碍与高血小板反应性独立相关[16]。因此，内皮功能障碍可能对更高的血小板反应性具有累加效应，导致更多的载体中的心血管事件[17]。另外，已有研究报道奥美拉唑作为一种强效的CYP2C19抑制剂，经常用于肺动脉高压患者的治疗，已经显示奥美拉唑的合用会增加经CYP2C19氧化代谢的药物的血浆浓度[18]。

本次研究的结果显示，CYP2C19 rs12248560基因型与等位基因频率分布差异有统计学意义，并且CYP2C19 rs12248560 T/T基因型和T等位基因与心力衰竭合并肺动脉高压显著相关，说明了CYP2C19 rs12248560基因多态性在心力衰竭合并肺动脉高压发生过程中是危险因素。本研究中虽然分析了CYP2C19的基因型、等位基因与心力衰竭合并肺动脉高压发展的关系，但由于样本量局限，在后续研究中需进一步扩大样本数量。遗传多态性在很多复杂性疾病研究中被认为发挥着重要作用。建立预测性生物标记物用于早期评估心力衰竭合并肺动脉高压是非常有必要的，通过检测基因多态性的预处理识别能够指导临床医生开展合理的治疗，对稳定患者病情非常有帮助。我们的研究提出了CYP2C19基因多态性与心力衰竭合并肺动脉高压发生的关联，并指出了CYP2C19 rs12248560 T/T、等位基因T能够作为心力衰竭合并肺动脉高压发生的危险因素，可以作为早期预防心力衰竭合并肺动脉高压的临床标记物。

综上所述，CYP2C19多态性与心力衰竭合并肺动脉高压发生显著相关，检测其多态性对早期发现心力衰竭合并肺动脉高压有一定价值。