基于荧光免疫技术检测降钙素原的方法建立和性能评估

章思思，张闻，周海滨，陈媛，周广亮

(宁波瑞源生物科技有限公司，浙江 宁波330200)

降钙素原（PCT）是一种无激素活性的糖蛋白，是降钙素前肽物质，正常情况下由甲状腺C细胞产生，含量极低。当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，它在血浆中的水平升高[1-3]。自身免疫、过敏、局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高或仅轻微升高。血中PCT的升高可能与细菌内毒素脂多糖、细胞因子诱导体内甲状腺外组织产生大量PCT有关[4-6]。

PCT反映了全身炎症反应的活跃程度．目前已成为临床全身性细菌感染诊治过程中必不可少的项目之一，从产生和消除的动力学过程来看，PCT也是最适合用作临床诊断指标的，用于监测抗生素治疗效果[7]。另外，PCT浓度变化对新生儿败血症、重症肺炎、支气管哮喘、术后感染等疾病的预警、鉴别诊断、病程监控和预后都有指导意义[8，9]。

现在市场上应用较多的PCT的检测方法：酶联免疫吸附法、化学发光法、胶体金试纸条法。然而，酶联免疫吸附法所需检测的时间较长；化学发光法的成本较高；胶体金法不能对检测结果进行定量。因此，具有较强的特异性，而且操作简便、测试时间短、重复性好的荧光免疫层析定量法是体外诊断行业中的发展趋势。本研究基于荧光免疫定量测试技术，干化学层析法，建立一种快速定量检测PCT的方法，对其性能进行了系统评价，并以降钙素原检测试剂盒 （VIDAS BRAHMS PCT酶联荧光分析技术）做为参比试剂行了对比验证。

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．1．1 材料与样本 收集2017年3月，宁波市第三医院125例血清标本。收集2017年8月，江西省人民医院同一病人的血清、血浆和全血样本各50例。PCT抗原、鼠抗人PCT单克隆抗体（hytest）；PCT多克隆抗体(Hytest)；羊抗兔IgG抗体(武汉艾美捷)；兔 IgG(杭州隆基)；硝酸纤维素膜（NC 膜）、吸水纸(上海良信)；PVC 底板(上海捷宁)；荧光粒子(Life Technologies Corporation)；Tris-HCL、NHS、 酪蛋白 (sigma)；BSA(Moregate Bio Tech)；EDC(TCI)；Tween20(AMRESCO)；MES(罗氏诊断产品)；阻断剂(杭州曼尼)；叠氮钠(西安庆峰医药化工)．台式高速冷冻型微量离心机(大龙兴创实验仪器)；超声波细胞粉碎机 (宁波市先倡电子)；三维平面点膜喷金仪、微电脑自动斩切机、压壳机(上海金标)；电子天平(梅特勒-托利多)。

1．2 制备方法

1．2．1 荧光微球抗体标记物的制备 取0．1ml的荧光粒子，清洗 3次(50mM MES清洗)后，加入 0．7mg的活化剂 EDC和0．7mgNHS，混匀，置于 37℃活化20min．离心，以质量比(荧光粒子：抗体)8．33：1 的最终浓度加入鼠抗人PCT单克隆抗体，置于4℃，交联12h。 再加入0．066g的BSA，置于37℃封闭 1h。封闭结束后，10℃下，15000r/min，离心 30min，用1ml缓冲液保存(50mM MES)，即为降钙素原荧光标记抗体．质控荧光标记抗体的制备方式仅改变抗体为羊抗兔IgG。

1．2．2 检测缓冲液配置 粒子稀释液：Tris-HCL pH8．5、0．75% 酪 蛋 白 、0．5%Tween20、0．9%NaCL、0．1%叠氮钠．以降钙素原荧光标记抗体终浓度1/200，质控荧光标记抗体终浓度1/1500，阻断剂1/60的比例，其他以粒子稀释液补充，配置检测缓冲液。

1．2．3 检测线及质控线的制备 取抗PCT多克隆抗体终浓度分别为 3．0mg/ml，喷量 1．0μl/cm，划膜仪平台移动速度100mm/s在硝酸纤维素膜上制备检测线；取兔IgG终浓度为5mg/ml，用同样方法制备质控线，室温干燥．检测线与质控线在NC膜上之间的距离约 4．0±0．1mm，线的宽度约 0．8～1．0mm；前后均匀；并置温度 15～26℃；湿度≤30%；干燥24h以上。

1．2．4 组装 在温度15～30℃； 湿度≤25%条件下，将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC底板等物组装，要求材料附着牢固，膜条切割应宽为4．0±0．1mm，然后装入塑料壳。

1．3 评价方法

1．3．1 准确度评价(回收实验)参照《体外诊断试剂分析性能评估(准确度-回收实验)技术审查指导原则》[10]，以1/9的体积混合，制备待回收分析样本和基础样本，对样本进行5次重复测定，取其均值计算回收率，回收率（%）=（回收样本-基础样本）/加入浓度X100。其回收率应在[85%，115%]，才满足降钙素原试剂盒的行业标准。

1．3．2 精密度评价 参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP15-A3文件[11]，连续测定高、低值样本20次，计算变异系数，以此作为批内精密度．每天检测一批两个浓度水平的样本，每批重复2次，连测20d，通过统计计算日间精密度。

1．3．3 分析特异性(抗干扰)评价 取多份样本，混成两份不同浓度的混合样本，在混合样本中添加生理盐水和不同浓度的干扰物，分别配制对照样本和干扰样本，干扰样本配制成由生理至病理水平各种干扰物，各项目梯度值详见2．3。每样本重复测试5次，计算样本和对照样本的测值偏差。干扰物测值偏差＜20%视为无干扰。

1．3．4 线性范围评价 用超过线性范围高值浓度的抗原，按等比例稀释至浓度0．1ng/ml以下，共5点(Xi)．对每一浓度的样本各重复检测5次，计算检测结果平均值(Yi)，以(Xi)为自变量，(Yi)为因变量求出线性回归方程，计算线性相关系数r，稀释浓度(Xi)代入线性回归方程，计算Yi的估计值及Yi与估计值的相对偏差或绝对偏差．降钙素原检测试剂盒行业标准要求线性相关系数|r|应不小于0．990。

1．3．5 检测限 用0值抗原和低值抗原作为样本进行检测，重复测定10次．计算信号T/C平均值(x)和标准差(SD)，根据0值和低值浓度结果进行两点回归拟合得出一次方程，将x+3SD代入方程计算得出对应的浓度值即为最低检测限．降钙素原检测试剂盒行业标准规定：生产企业应提供试剂盒的检出限不高于 0．2ng/ml。

1．3．6 稳定性试验结果 在试剂第6个月、第12个月、第18个月、第21个月时，分别做回收、批内CV、线性、检测限试验，分析试验结果，根据试验结果判定试剂盒的稳定性。

1．3．7 钩状效应试验 本试剂考虑因标记或包被抗体量不足，抗原过剩导致的后带效应．参考临床可能达到的阳性高值，采用高浓度的降钙素原纯品进行梯度稀释， 浓度分别为(ng/ml)：50、100、200、300、400、500，每种浓度的抗原重复测试5次，以响应值(T/C)作为判断依据。

1．3．8 临床标本检测结果 根据CLSI EP9-A3文件[12]，同时采用本试剂盒与VIDAS-PCT两种试剂分别随机检测125例血清样本．用检测结果比较，计算两种方法检测结果的相关性和阴阳性符合率．来自同一个病人的血清、血浆和全血样本各50例，比较同一病人3种不同样本的检测结果偏差。

1．3．9 统计学处理 使用SPSS 22．0软件进行统计分析，检测结果间的比较采用T检验进行分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

本试剂盒应用1株高特异性、高敏感性抗人PCT单克隆抗体和1株PCT多克隆抗体，以双抗夹心法对样本中的PCT进行检测．检测缓冲液与样本在检测管中混合，缓冲液中的荧光标记的PCT单克隆抗体Ⅰ与样本中的PCT抗原结合形成抗原抗体复合物，当混合样本被滴加到反应板的样品孔，经由层析作用流向NC膜的另一端，被包被于膜上检测区的PCT多克隆抗体Ⅱ所捕获，同时检测缓冲液中的荧光标记的羊抗兔IgG被包被与膜上质控区的兔IgG所捕获．经由干式荧光免疫分析仪处理检测区和质控区的荧光信号，计算转换出样本中PCT的浓度值。

2．1 回收实验 根据计算，两个分析样本的回收率分别为110%和98%，平均回收率为104%，两个样本回收率与平均回收率的差值均小于±15%．回收实验是评价试剂盒准确度的一种方法，回收实验结果好，可以认为，试剂盒的准确度符合行业标准要求。见表1。

2．2 精密度实验 选择两个水平浓度的样本，分别进行批内和日间CV实验。批内CV为4．38%和5．71%，小于 10%；日间 CV 为 5．49%和 6．56%，小于15%。见表2。

表1 回收实验结果

2．3 分析特异性实验 混合的两份样本浓度分别为0．5ng/ml和10ng/ml，在两份样本中加入不同浓度的干扰物，再测定PCT的浓度．加入不同量的血红蛋白，使其终浓度为(g/l)：2、4、6、8、10，其他干扰判断类似血红蛋白．甘油三酯的浓度与血红蛋白相同，游离胆红素与结合胆红素的干扰浓度分布(mg/ml)：4、8、12、16、20。 类风湿因子浓度为(IU/ml)：40、80、120、160、200。肝素钠浓度为(IU/ml)：2．5、5、7．5、10、12．5。 乙二胺四乙酸钠盐浓度为(mg/ml)：0．3、0．6、0．9、1．2、1．5。 枸 橼 酸 钠 浓 度 为 (mg/ml)：0．76、1．52、2．28、3．04、3．8。 样本中含以上浓度的干扰物，测得的结果均在±20%内，判断上述干扰物对PCT检测无影响。见表3。

2．4 线性实验 采用高浓度抗原为原液，以4．89倍的比例依次稀释下来，用理论浓度与PCT实测浓度作图， 显示 PCT 浓度在 0．05～53．21ng/ml内呈良好线性，斜率 K=0．9988，截距 B=0．0741，线性相关系数r=1．000，在行业标准要求范围内．检测平均值与估算值的相对偏差均＜±5%，绝对偏差均＜±0．5，说明检测值有很好的梯度关系，即样本梯度稀释下来，所检测的信号梯度很好，进一步说明线性相关性好。见图1。

2．5 检测限 分别对0值样本和PCT低值样本进行 10次检测，得到回归方程 Y=7．4492X-0．0246，将0值样本x+3SD的结果代入回归方程，计算得到检出限为0．02ng/ml．检出限结果在降钙素检测试剂盒行业标准范围内。见表4。

表2 精密度评价结果

表3 不同干扰物对试剂的干扰实验结果

图1 PCT线性范围验证

表4 检测限实验结果

2．6 稳定性实验结果 试剂盒放置6个月、12个月、18个月和21个月后，进行检测，其检测结果都满足 1．3．1、1．3．2、1．3．4、1．3．5 的要求， 可以判断试剂盒的有效期满足18个月。见表5。

表5 稳定性试验结果

2．7钩状效应试验 用0值校准品稀释高浓度的降钙素原纯品，得到待分析物浓度为(ng/ml)：50、100、200、300、400、500，测试样本的响应值。PCT 浓度从50ng/ml升到400ng/ml时，信号随浓度增加而变大；而PCT 500ng/ml的信号反而低于400ng/ml浓度时的信号。由此可得：PCT浓度高达300ng/ml时未出现钩状效应。见表6。

2．8临床样本检测结果 用本试剂盒和VIDASPCT两种试剂同时对125例临床标本进行定量分析，见图2。对两种试剂测得的结果进行T检验分析，两者差异无统计学意义(P＞0．05，无显著差异)，其相关性好，相关系数r=0．9951，直线回归方程为Y=1．0111X+0．2498。 同时对 125 份样本进行 Kappa一致性分析，Kappa 系数为 0．885＞0．75， 认为两系统高度一致，等效，见表7。

表6 钩状效应实验结果

图2 临床样本相关性曲线

表7 Kappa一致性分析实验结果

对于来自同一病人的血清、血浆和全血样本各50份检测后，进行相关性分析．血清与血浆对比线性方程为：Y=0．9879X-0．0455 r=0．9938； 血清与全血对比线性方程为：Y=1．044X-0．098 r=0．9875；血浆与全血对比线性方程为：Y=1．0589X-0．0607 r=0．995．可以看出，本试剂对血清、血浆和全血样本的检测，一致性良好，结果没有明显差异，说明试剂可同时用于以上3种样本的检测，方便临床使用。

3 讨论

PCT是一种由甲状腺细胞合成的小蛋白，分子量13kDa由CALC-1 gene编码，通过剪切pre-pro-calcitonin(141氨基酸单位的肽链)得到procalcitonin/pct．PCT是由116个氨基酸组成的肽链，包括N端氨基酸、活性降钙素和降钙蛋白三部分[13]．在 健 康 个 体 中 的 浓 度 非 常 低 ＜0．1ng/ml；PCT ＜0．25ng/ml不主张使用抗生素；＞0．25ng/ml主张使用；＞0．5ng/ml强烈主张使用[14，15]．因此可根据 PCT浓度作出是否存在细菌性感染的初步诊断，并选择是否使用抗生素，以减少抗生素的泛滥、减轻病患的经济负担及降低细菌耐药性的发生机率。

本试剂盒中的每个PCT检测卡均有一个内部质控的过程以确保使用时日常质控的需求，该质控程序在每个病人样本测试即同时执行．一旦检测卡正确插入瑞易测干式荧光免疫分析仪中，仪器将完全识别．不正确的质控信息将会在瑞易测干式荧光免疫分析仪上显示出错误信息，将需要进行重新测试．本研究结果显示应用荧光免疫层析法检测降钙素原具有检测限低、线性范围广、准确度和精密度高、分析特异性高、稳定性好、操作简单等特点，能满足大小医院的检测需求。